COVID-19関連追加(20201228日)

 

変異株VOC 202012/01 その2

【著明な高ウイルス量と関連したS-variant SARS-CoV-2

Kidd M, et al. S-variant SARS-CoV-2 is associated with significantly higher viral loads in samples tested by ThermoFisher TaqPath RT-PCR. medRxiv. Posted Dec 27, 2020.

https://doi.org/10.1101/2020.12.24.20248834.

Abstract

バーミンガム大学ターンキー研究所は,英国政府の”テスト&トレース”スキームの下で臨床検査を担当するLighthouse networkの一部である.サンプルは,Thermofisher TaqPath RT-QPCR test3つのSARS-CoV-2ウイルス遺伝子を共増幅させるようにデザインされている)によって呼吸器サンプル中のSARS-CoV-2の存在を分析される.SARS-CoV-2の懸念される変異株(S-VoC: SARS-CoV-2 variants of concernの存在に関する最近の情報が入手可能になり,Lighthouseの大多数の研究所で使用されているThermoFisher TaqPathのようなRT-QPCR試験では最適でないプロファイルを示す可能性があるS-VoCついて,最近発表されたデータを分析し,S遺伝子の「dropout」変異の傾向と重要性を調査した.

結果は以下.

@S遺伝子が検出されたサンプルと比較して,S遺伝子が検出されなかったサンプルでは,ORFおよびN遺伝子ターゲットのCt値中央値が有意に低かった

A集団ベースでは,S遺伝子の「dropout」サンプルは,ORFおよびNターゲットの非常に低いCt値の周囲にクラスタリングされている

B個体サンプルとしてリンクされたCt値は,ORFNの低いCt値が明らかに「S-dropout」特性と関連していることが示された

CCt値から相対的なウイルス量を推定すると、S陽性サンプルが10%であったのに対し,S-dropout」サンプルの約35%がウイルス量1×106よりも1010,000倍を超える高ウイルス量を有していた

 

この解析から,TaqPath検査でS-dropout」プロファイルを示すサンプルを有する患者は,サンプリング時のウイルス量が高い可能性があることが示唆された.英国の地域におけるSARS-CoV-2の急速な感染拡大の疫学的報告との関連性が議論されている.

 

 

Results

Frequency analysis of TaqPath Ct values from SARS-CoV-2 positive samples:

Figure 1は,陽性サンプル範囲にわたるウイルスORF遺伝子Ct値分布を示しており,ORFおよびN遺伝子検出のサンプル結果の多段階分布の可能性を明らかにした(後者は示していない).これは,Ct22-24におけるCt頻度のnadirで最も明らかであった

Figure 1: Simple frequency analysis of ORF gene Ct values from 641 positive samples, with a bin size of 0.5. Arrow and bar on the X-axis indicate nadir of frequency and Ct values, respectively. A Ct of 45 is displayed in the analysis and denotes “no signal detected” in the assay.

Frequency analysis for all three gene targets:

Figure 2S遺伝子陰性の割合が高いことを示している; ORFN遺伝子未検出の陽性プロファイルを持つサンプル数(64113, 2.0%)と比較し,右端のS遺伝子未検出のプロファイルを持つサンプル数(641178, 27.7%に注目.Figure 2のプロファイルをさらに観察すると,ORFおよびN遺伝子の検出頻度が低いCt値(922)では,対応するS遺伝子の検出頻度が低い傾向にあるが,Ct2533以上では,3つのウイルス遺伝子すべての検出頻度が類似しており,この傾向はあまり顕著ではないことがわかる.特に,検査感度範囲の極端(Ct3344)では,ORFNおよびSは,どの遺伝子標的に対しても明らかな感度の低下がなく,ほぼ等しい頻度で検出された.

 

 

Figure 2: Dot-plot frequency analysis showing the relationship between three viral gene targets detected by the TaqPath RT-QPCR test, across the full range of Ct values. Y-axis is divided into a low frequency range of 0-30 and a high frequency range of 50-250. A Ct of 45 is artificially assigned to represent results where no signal was detected in that assay.

 

 

S-gene undetectable samples had significantly lower median Ct than ORF- and N-gene:

S遺伝子未検出サンプルがORFおよびN遺伝子陽性サンプルより低いCt値と有意に関連しているかどうかをさらに判断するために,S陰性/陽性サンプルの分布を,すべてのORFおよびN陽性内で比較した(Figure 3).いずれも,S陰性およびS陽性のCt値中央値は有意差を認めた; Table 1を参照(いずれもp< 0.0001).S陰性サンプルは,ORFおよびN遺伝子のCt値範囲で発生したが,非常に低いCtORFおよびN遺伝子周囲にS陰性のクラスタリングが明確に見られ,おそらくより低いCt値中央値を説明する

Figure 3: Scatter plot of the population of S-gene negative and positive Cts within corresponding ORF and N-gene positive samples. Median Ct is shown by a black horizontal bar and above both plots the results of tests for significant differences are shown with conventional notation.

 

Table 1: TaqPath RT-QPCRにおける陽性サンプルにおけるCt値中央値(+上下四分位).結果は,ORFまたはN遺伝子のいずれかが陽性であった各グループについて,S遺伝子陰性または陽性サンプルについて分けている.ORFおよびN-遺伝子のどちらのグループにおいても,S陰性およびS陽性ターゲットのCt値中央値は有意に低かった(Mann-Whitney 'U'; 両側検定; p< 0.0001).いずれの場合も,Ct値中央値の差は,S陰性群で10 100倍高いウイルス量を表している.

 

Table 2: Verification data from the Lighthouse Turnkey laboratory.

EQAサンプル希釈シリーズにおける不活化SARS-CoV-2ウイルス溶解液1mLあたりのコピー数と,TaqPath検査で増幅されたさまざまなウイルス遺伝子ターゲットについて得られたCt値との関連を示す.

 

 

Comparisons of linked Ct values for individual samples show a propensity for Snegative samples to be associated with a lower Ct for ORF and N gene targets:

S遺伝子陰性プロファイルがORFおよびN遺伝子ターゲットの低いCt値と関連していることについて,各陽性サンプル内における関係を調査した.S遺伝子陰性サンプルはCt値範囲にわたって発生したが,それらは範囲の下限に向かって最も顕著に現れる.この観察がグラフ化され,ORF陽性群におけるS陰性およびS陽性カテゴリーにおいて,Ct値が15未満のサンプル数のカイ二乗分析を行った,この分析では,割合において著明な有意差を認めた(χ21, N= 628= 36.61, p< 0.001).ORFおよびN遺伝子陰性サンプル13個のうちのいくつかは,低いCt値にも関連しており,ターゲットの特異的増幅を妨げる可能性のある変異についてさらに調査すべきである.

Figure 4: 個人の陽性サンプルのウイルス遺伝子Ct値の散布図.サンプルの3つのCt値の各セットは,灰色の点線で結ばれている.その検査でシグナルが検出されなかった検査を表すこの分析において,Ct45が示されている.

 

Discussion

集団へのSARS-CoV-2拡散に対する英国の主要な対応の一つは,主要な部分は、high-throughput RT-QPCR検査の実施センターを設置し運営してきたことである.これらのセンターは,ThermoFisher 'TaqPath' 検査を中心とした RT-QPCR検査プロセスを採用することで標準化されている.

最初の数ヶ月間のデータ分析では,SARS-CoV-2陽性サンプルの高い割合が示されているが,これはウイルスのS遺伝子ターゲットが検出不能で,他の2つの遺伝子ターゲットであるORFN遺伝子が明確に検出されている(「S-dropout」サンプル)さらに分析を進めると,S-dropoutサンプルのかなりの割合で,同じサンプル中のORFおよびNCt値が低いことに関連していることが判明した; これらのサンプルでは相対的に高いウイルス量が推測される

S-dropoutサンプルから推定される高いウイルス量は,個人の感染性を決定しうることは明らかであり,その結果,ウイルス伝播能力が決定される可能性がある.S-dropoutサンプルとS-検出サンプルにおける集団のCt値中央値の有意差は,S-dropoutサンプルとしてのターゲット濃度において10100倍の増加を示している.ORFおよびNCt値が915を示すS-dropoutサンプルのクラスター(それぞれ6317835.4%; 4645010.2%))は,101000倍の相対的なウイルス量の増加に対応するものである.

TaqPath検査のQnostics EQA検証データ(Table 2)に基づくと,Ct値が約1516の場合,1×106 copies/mLのウイルス量に相当する.したがって,Ct値が15未満で観察されたS-dropoutサンプルの集団は,最大10,000倍のウイルス量を有するかなり大きな感染者集団を推定していることになる.このような感染伝播能力の上昇は,英国の南東部、そしておそらくそれ以上に広がっていると思われるS-VoCに起因していると考えられているが,疫学的には,臨床的なウイルスの性質から,人間の行動的要因を含むより効率的な広がりの理由を切り離すことは困難である.

我々は,非常に低いORFおよびN Ct値におけるS-dropout陽性結果の代替的な説明を考えた.一つは,高いウイルス量を有する時に複数のターゲットを増幅する場合,個体のRT-QPCR反応における化学成分が不足し,S遺伝子ターゲットが最初に増幅不能になる可能性があるということである.しかし,TaqPath検査はnon-human bacteriophage MS-2の共増幅によって提供される内部制御を含んでおり,そのターゲットRNAは、3つの特定の遺伝子ターゲットのいずれよりも,不利な反応条件下で検出不能になる可能性が高い濃度で含まれている; すべての特定の標的の増幅が阻害されていないことを再確認することができる.データ表のすべてのTaqPath検査の陽性結果は,MS-2増幅の存在によって決定され,妥当とされるため,S遺伝子のdropoutが一般的な反応化学のバイアスによるものである可能性は非常に低いと考えられる.

第二に,培養され,不活化した全SARS-CoV-2 RNAを用いたEQA標準希釈シリーズを用いたTaqPath検査の検証では,Ct値が約15S遺伝子ターゲットがdropoutする挙動は観察されなかった.この検証の事前観察が第二の理由である.

各サンプルの結果の信憑性は,S-dropout現象の存在によって影響を受けないことを強調する.TaqPath RT-QPCR検査結果は,少なくとも2つの遺伝子ターゲットが検出された場合に「陽性」として分類される.このように,3つのウイルス遺伝子ターゲットを検出するTaqPath検査の能力は,ウイルスの突然変異によりそのうちの1つが検出不能となった場合でも,「テスト&トレース」プログラムにある程度の堅牢性を提供する.我々は,他のORFおよびN遺伝子についても明らかなdropoutを観察したが,その頻度はかなり低く,高ウイルス量とは明らかに関連していなかった.また,double dropout2つのウイルス遺伝子がサンプル中で増幅されなかった場合)は陰性結果として分類され,データセットに含まれないため,ここには記載していない.より網羅的な分析では,1つのウイルス遺伝子が増幅されたすべての陰性結果を検討する必要がある.

Limitation: @我々の分析は,S-VoCが集団間でより急速に伝播している理由を説明するための裏付けとなる証拠を提供しているが,ウイルス量の増加がどのようにして起こるのかを説明するものではない.Aサンプル中の相対的なウイルス量について広い範囲の推論を行ったが,TaqPathSARS-CoV-2の定量的なアッセイではなく,我々の観察は希釈シリーズまたは有効な定量法によって繰り返す必要がある.BRT-QPCRS-dropout現象とRT-QPCR検出を阻害することが知られている特定のウイルス変異との直接的な関連性はなく,各サンプルの全ゲノムシークエンシングは有用であろう.Cこの解析に含まれる各サンプルについて,時間的または地理的なデータは得られていない.

 

 

 

 

 

COVID-19関連追加(20201228日)変異株VOC202012/01 その2

1230日追記しました

 

VOC 202012/01変異株の観察】

Public Health England. Investigation of novel SARS-CoV-2 variant. Variant of Concern 202012/01. Technical briefing 2 (2020, 12/21)

Current epidemiological findings:

全ゲノムシークエンシングによってVOC 202012/01の全新規症例のごく一部のみが同定され,典型的にはこのデータの検査は約2週間遅れており,したがってSGTFS gene target failureVOCキャリア(carriage)を示すために代用される.私たちは以前、VOCS遺伝子変異の1つであるアミノ酸6970を欠失する変異(Δ69-70が,3ヶ所のUK lighthouse laboratoriesで使用されているThermopath TaqPathアッセイで再現性のあるSGTFを引き起こすことを観察した(Technical Briefing 1を参照).したがって,この偶然の発生は,VOC 202012/01のモニタリング傾向の良い代理となる.SGTFは,Δ69-70の存在とほぼ完全に相関している我々が配列とSGTF statusのどちらもわかっている検査サンプル14,950個を考慮すると,Δ69-70配列の99.3%1,843個のうち1,831個)がSGTFであるのに対し,欠失のない配列の0.05%13,107個のうち7個)がSGTFであるΔ69-70は複数回発生しており,SGTFはその変異を有する任意の系統の代理であり,VOC 202012/01の代理としてのSGTFの有用性は,時間と領域によって異なるTable 2は,すべてのpillar 2配列について,VOC 202012/01であることが確認されたΔ69-70配列の週次割合を示す.Table 3は,12月中の英国におけるVOC 202012/01であるΔ69-70の割合を地域別に分けて示したものである.予想通り,最初にVOCが観測された地域で最も高いが,12月の間に英国の全地域で実質的に過半数を占めている.これらのTableの数値はシーケンシングされたサンプルに基づいており,そのうちのいくつかは同じ個体からのものである可能性がある(この影響は小さい可能性がある).

 

 

Table 1:

Table 2:

 

3ヶ所のlighthouse laboratoriesS遺伝子 dropoutを検出する方法を用いて検査された英国のサンプルの割合はかなりのものであり,時間経過とともに相対的に一定している(Figure 1).このアッセイで検査されたSGTF症例の割合は12月に入ってから,すべての年齢層で増加し続けており,25-49歳では最も顕著であった.SGTF症例の空間分布をみると,南東部とロンドン,南西部の一部,カンブリア州で相対的に高い負荷が示されている.イングランド東部では,3ヶ所のThermofisher TaqPath検査室のカバー率が低いため,この地域でのSGTF発症率を分析することはできない.北西部では確認可能なゲノムデータが少なく,追加のシークエンシングが行われている.

Figure 1:

 

 

Figure 2:

Figure 3:

 

 

Figure 4:

Figure 5:

 

Preliminary findings of matched cohort study:

マッチングコホート研究は,VOCに関連した入院および症例死亡アウトカムの暫定評価のために実施された.配列決定された陽性SARS-CoV2症例の解析には,比較のための野生株確定症例(変異株配列とは異なる配列に分類された)とのマッチングが行われたVOC確定症例が使われた.変異株(VOC 202012/01)と野生株の症例を可能な限り比較するために最適化し,シークエンシングのためのSARS-CoV-2症例はランダム化されていないので,それぞれの症例を年齢,性別,居住地の上位自治体(UTLA: upper tier local authority),そしてサンプル採取日の2週間の期間ごとに1:1でマッチングした.

解析時に確認された変異株2,693人のうち,サンプル採取日が2020920日〜1215日までの変異株症例1,769人を野生株比較例1,769人とマッチングし,本解析に含めた.マッチング基準の反映から,変異株症例の年齢中央値は36歳,野生株症例の年齢中央値は35歳であった.また,野生株症例の51.4%は女性であった.

変異株3,538人と野生株を比較したところ,変異株は白人が多く(75.2%,次いでアジア人(10.1%),黒人(5.9%)であった.野生株比較例の民族的特徴はほぼ同様であったが,アジア系の割合が高かった(13.5% vs 10.1%).

大多数の変異株症例は個人住宅に居住していた(変異株95.0%,野生株94.3%).変異株症例は,野生株症例と比較して,住宅クラスター14日以内に同じUnique Property Reference NumberUPRN)で発生したすべての臨床検査で確認された症例と定義)の一部である可能性が高かった(63.5% vs 56.1%, カイ二乗検定 p= 0.00

NHSの入院データを調べたところ,3,538人のうち,サンプル採取日以降に入院記録があるのは42人であった.野生株比較例(26人(1.5%))と比較して,入院した変異株症例数は16人(0.9%)と少なかったが,その差は有意ではなかった(カイ二乗検定 p= 0.162.入院データ収集に時間の遅れが生じる可能性があるため,同定された入院患者数は最低限の入院患者数とみなすべきであり,将来的にはさらなる入院データがこのNHSデータセットに収集される可能性がある.

28 日間症例致死数(The 28-day case fatalityに関して,変異株症例と野生株比較症例の評価を行った.解析は,サンプル採取日から28日が経過した2,700人に限定したサンプル採取日から28日以内の死亡数は,野生株比較症例は1,360人中10人(0.73%)であった一方,変異株症例は1,340人中12人(0.89%)であった(オッズ比1.21, p= 0.65

Re-infection:

再感染の可能性を同定するために検査データを使用した; これらの再感染は,最近にPCR陽性検出日の少なくとも90日前にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)陽性のエピソードとして定義された.変異株症例では,再感染症例2人が認められたが,比較症例で再感染症例3人が認められた(1.701000 cases, Fishers exact , p= 1.00

同じ定義をSGTF症例にも適用した.これらのSGTF症例には,OrfおよびN遺伝子のCt値が< 31S遺伝子はCt値に関係なく、その有無に基づいて陰性または陽性と定義されたサンプルが含まれていた.全国のSGTF症例の再感染検出率は0.60/1000であったのに対し,非SGTF症例の再感染検出率は0.61/1000であった(p= 0.94地理的にケント州に限定した場合,再感染の検出率は0.51/1000であったのに対し,非SGTF症例では0/1000であった(p= 0.69

Secondary attack rates:

イングランドの全国的な接触者追跡システムであるNHS Test and Traceのデータを用いて,二次発病率(secondary attack rate)を調査した.2020105日〜126日においてNHS Test and Traceに報告された症例は1,105,388人であり,46,237人(4.2%)がゲノムシーケンシングデータを持っていた(約700人(1-2%)は質が悪い).1,978人が変異株(VOC 202012/01)を有しており,そのうち4.3%がシーケンシングデータを有していた.

この期間中で,症例によって通知されたすべての接触者のうち228,361人(二次発病率9.9%)が症例となった:

指標症例がVOC 202012/01確定症例であった場合は,15.1%

指標症例が他の変異型症例であった場合は9.8%

Summary:

SGTF症例のデータ解析から得られた知見は,ゲノムデータのマッピングから観察された症例の空間的分布とほぼ同様のものであった.SGTF症例は,南東部,ロンドン,南西部,カンブリアで多く見られた.このような地域差は,3ヶ所のThermofisher TaqPath  lighthouse検査室によるカバーが限定されているイングランド東部のような地域では解釈に注意する必要がある.しかし,相対的にカバー率が一貫して高い地域では,この結果はVOC 202012/01感染の負荷を代用することができる. この暫定的なコホート研究の結果では,変異株(VOC 202012/01)症例と野生株症例の間には,入院および28日間症例死亡数に統計学的有意差は認めなかったまた,変異型症例と比較症例の間では,再感染の可能性に有意差は認めなかった