COVID-19関連追加(202112日)

 

【シリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2の重症度と伝播効率は,

空気を介した曝露では増加するが,fomites曝露では増加しない】

Port JR, et al. SARS-CoV-2 disease severity and transmission efficiency is increased for airborne but not fomite exposure in Syrian hamsters. bioRxiv. Posted, Dec 28, 2020.

https://doi.org/10.1101/2020.12.28.424565.

Abstract

SARS-CoV-2感染伝播は,接触,fomites,空気伝播によって引き起こされる.さまざまな感染経路の相対的な寄与度については,まだ議論の余地がある.ここでは,シリアンハムスターが,鼻腔内,エアロゾル,空気,fomitesによる曝露によって,SARS-CoV-2に感受性があることを示した.曝露経路が異なると,異なる疾患症状を示すことがわかった経鼻およびエアロゾル播種は,より重症の呼吸器病理,高ウイルス量,および体重減少を引き起こしたfomitesに曝露した場合は,抗炎症性免疫状態と遅発性排出パターンを特徴とする軽度の疾患症状を示した呼吸器ウイルス排出の全体量は疾患の重症度とは関連していなかったが,排出の開始(onsetは関連していた早期排出疾患重症度の増加と関連していた空気感染伝播は,空気の流れの方向に依存しており,fomites感染伝播よりも効率的であった

Results

Clinical disease severity is correlated with exposure route:

曝露経路が疾患の重症度に及ぼす影響を調べるために,3つの播種経路を比較した.4-6週齢の雌ハムスターを3群に分け,経鼻播種(I.N.: 8×104 TCID50),エアロゾル播種(1.5×103 TCID50),fomites播種(8×104 TCID50)を行った(Figure 1a).比較のために,未曝露コントロール群(N= 12)を含めた.各群について,動物4匹を1 day post inoculationDPI)(1日後播種)および4DPIで安楽死させ,残りの動物4匹を14 DPIまで観察した.I.N.またはエアロゾル経路を介して播種した動物は,有意な体重減少を示したが,fomites曝露は限定的で一過性の体重減少をもたらしたI.N.播種した動物は3DPIで体重減少を開始し,エアロゾル曝露は2DPIで体重減少を開始した(Figure 1b6DPIでの体重減少は,I.N.群では未曝露コントロール群に比べて有意であり,エアロゾル群では4DPIでの体重減少が認められた(Figure 1b; N= 4, Mann-Whitney検定, それぞれp= 0.0286およびp= 0.0286. 体重減少に加えて,一貫性はないが,一時的な,軽度の嗜眠,毛並みの乱れが観察された.fomites曝露群は,未曝露コントロール群と比較して、体重増加が少なかった.14DPIでは,群間に有意差は観察されなかった(Figure 1c; N= 4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.2953).

 

 

Figure 1: Disease severity in Syrian hamsters.

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a. Experimental layout for intranasal (I.N.), fomite and aerosol exposure experiments. White circle: inoculation, black: necropsy, grey, swab time-points b. Relative weight loss in hamsters after SARS-CoV-2 inoculation over time (DPI = day post inoculation, n = 4 per group). The lines represent mean ± SEM. Black line indicates weights of unexposed control group. Dotted vertical line represent averaged peak weight loss post inoculation or exposure. Statistical significance was measured using a Mann–Whitney two-sided test, p-values are shown. c. Violin plot with individuals and median of weight gain at 14 DPI. Statistical significance was measured using a Kruskal-Wallis test, followed by Dunn’s multiple comparison test. d. Violin plot with individual and median titers of infectious SARS-CoV-2 in the respiratory and intestinal tissues at 1 DPI and e. 4 DPI, Red: I.N, blue: aerosol, purple: fomite, black: unexposed; dotted horizontal line = limit of detection (0.5). GI = gastrointestinal tract; n = 4 per group. Statistical significance was measured using a two-way ANOVA, followed by Tukey’s multiple comparison test. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant.

 

 

Aerosol exposure directly deposits virus in the upper and lower respiratory tract, with replication in the nasal cavity epithelium, tracheal and bronchial epithelia:

初期(1DPI)のSARS-CoV-2のトロピズムと複製を曝露経路ごとに調査した.感染性ウイルスは、すべてのI.N.およびエアロゾル曝露動物の気管から検出された.肺では,感染性ウイルスは,すべてのエアロゾル曝露動物およびI.N.播種ハムスターのサブセットで検出された(Figure 1d).fomites群では,上気道,下気道のいずれにおいても,1DPIでは感染性ウイルスは検出されなかった.エアロゾルに曝露したハムスターは,I.N.曝露動物と比較して,この時点で気管および肺のウイルス量が有意に増加していた(N= 4, ordinary two-way ANOVA, その後のTukey多重比較検定,それぞれ p= 0.0115およびp= <0.0001).これは,エアロゾル曝露は下気道系にウイルス飛沫核をより効率的に沈着させることを示唆している.消化管では,播種経路にかかわらず感染性ウイルスは検出されなかった.

初期細胞性トロピズムを調べるために,1DPIに矢状切片および肺切片上において,SARS-CoV-2複製のマーカーとしてのSARS-CoV-2核タンパク質を標的とした免疫組織化学(IHC: immunohistochemistry)を実施した.エアロゾル播種動物では,鼻腔,気管粘膜、細気管支粘膜の中等度〜多数の線毛上皮細胞にウイルス抗原が観察された.加えて,I型およびII型肺胞上皮細胞(pneumocytes),肺マクロファージ,嗅上皮細胞でもウイルス抗原が検出された(Figure 2a, e, i, m).加えて,I型およびII型肺胞上皮細胞(pneumocytes),肺マクロファージ,嗅覚上皮細胞でもウイルス抗原が検出された(Figure 2a, e, i, m).一方,I.N.曝露したハムスターにおいては,この時点で気管および肺胞上皮細胞にはウイルス抗原は認められなかった。興味深いことに,1DPIで,I.N.播種ハムスターのサブセット(N= 2/4)の肺マクロファージからウイルス抗原が検出された.ウイルス抗原は,鼻甲介の線毛上皮および嗅上皮に検出された(Figure 2b, f, j, m).ウイルス学的所見によれば,どのfomites播種ハムスター(N=  0/4)の気管および肺からもSARS-CoV-2抗原は検出されなかった.また,fomites播種ハムスター1匹(N= 1/4)では,鼻甲介の線毛上皮細胞からウイルス抗原が検出された(Figure 2c, g, k, m).評価した動物のいずれにおいても(データは示されていない),また未曝露コントロール組織においても,SARS-CoV-2抗原は食道または脳からは検出されなかった(Figure 2d, h, l, m).

 

 

Figure 2: Comparison of early replication of SARS-CoV-2 in respiratory tract.

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Comparison of replication of SARS-CoV-2 for intranasal (I.N.), aerosol and fomite inoculated hamsters at 1 day post inoculation (DPI) by immunohistochemistry a, b, c. SARS-CoV-2 antigen detection in ciliated epithelial cells of the nasal mucosa (200x). d. Nasal mucosa from a control hamster (200x). e, f, g. SARS-CoV-2 antigen detection throughout tracheal ciliated epithelial cells (400x). h. Normal tracheal mucosa from a control hamster. i. SARS-CoV-2 antigen detection focused on terminal bronchioles and adjacent alveolar spaces (100x). j. Lack of SARS-CoV-2 in epithelial cells with strong antigen detection noted in pulmonary macrophages (inset) (100x). k. Lack of SARS-CoV-2 antigen detection throughout the lung (100x). l. Normal lung from control hamster (100x). m. Quantitative comparison of antigen detection for lung (type I and type II pneumocytes, macrophages (mos), mucosa of the trachea and skull sections (olfactory and ciliated epithelium of the nasal turbinates) at 1 day post inoculation for I.N., aerosol, fomite, and control groups.

 

 

Fomite SARS-CoV-2 exposure displays delayed replication kinetics in the respiratory tract and leads to less severe lung pathology:

曝露経路と続いて起こる呼吸器病理との相関を調べるために,肺,気管,鼻甲介切片を採取し,1DPIおよび4DPIの病理組織学的評価を行った.興味深いことに,1DPIには播種経路にかかわらずハムスターの一部に鼻甲骨病理が観察された(Figure 3a, b, c.病理組織学的病変は主に線毛上皮細胞で観察され,1DPにはI.N.播種群で最も一貫して観察され,すべての播種動物(N= 4/4)が多数の変性・非変性白血球の流入を伴う軽度〜中等度の線毛上皮細胞壊死を示し,エアロゾル播種群では75%N= 3/4)が最小限〜中等度の病変を示した.fomites播種群では,ハムスターの半数(N= 2/4)が鼻甲介の病理組織学的病変が最も一貫性がなく重度の低い病変を有していた(半数は病理組織学的病変を認めず,残りのハムスター(N= 2/4)は病理組織学的病変が軽微であった).軽度〜中等度の気管炎症は,エアロゾル播種ハムスターの全て(N= 4/4)と、I.N.播種ハムスターの半数(N= 1/2)で観察された(Figure 3e, f).気管炎症は,fomites播種ハムスターのいずれにおいても観察されなかった(N= 4; Figure 3g)ことから,1DPIで検出されたウイルス力価が,このモデルにおける早期発症の病理学的変化と関連していることが確認された.予想通り,肺の病理学的変化は,播種経路にかかわらず,1DPIで最小限であった(エアロゾルおよびfomites).肺の初期病理組織学的病変には,まれな単細胞細気管支上皮細胞壊死,細気管支粘膜への稀または少ない数の好中球浸潤,および浮腫による最小限の中隔肥厚および隣接する肺胞腔への稀な白血球滲出を伴う局所的な間質性肺炎が含まれていた(Figure 3i, j, k).

 

 

Figure 3: Comparison of the respiratory tract pathology of SARS-CoV-2 Infected hamsters.

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Comparison of SARS-CoV-2 pathology for intranasal (I.N.), aerosol and fomite inoculated hamsters at 4 day post inoculation (DPI) a. Infiltration and disruption of the ciliated nasal mucosa by moderate numbers of leukocytes with multifocal epithelial cell necrosis (200x). b. Multifocal disruption of the nasal ciliated mucosa by low numbers of leukocytes with accumulations of degenerate leukocytes in the nasal passage (200x). c. Intact ciliated nasal mucosa with normal mucus presence within the lumen (200x). d. A control nasal turbinate with intact ciliated nasal mucosa and mucus within the lumen (200x). e. Disruption of the tracheal mucosa with single cell necrosis and infiltration by low numbers of leukocytes (400x). f. Unaffected tracheal mucosa (400x). g. Unaffected tracheal mucosa (400x). h. Section of tracheal mucosa from a control hamster (400x). i-l. No significant histopathologic lesions in the lung of any inoculation route at 1 day-post-inoculation (100x). m. Multifocal disruption of ciliated nasal mucosa with accumulation of cellular debris and degenerate leukocytes within the nasal passage (200x). n. Severe disruption and multifocal erosion of the nasal mucosa with accumulation of numerous degenerate leukocytes and abundant cellular debris within the nasal passage (200x). o. Ciliated epithelial cell degeneration and mucosal erosion with leukocyte infiltration into the lamina propria (200x). p. Normal nasal turbinate from a control hamster (200x). q. Focal disruption of the tracheal mucosa by low numbers of leukocytes (400x). r. Multifocal infiltration of the mucosa by moderate numbers of leukocytes and multifocal epithelial cell necrosis (400x). s. Multifocal loss of epithelial cilia and infiltration of the lamina propria by moderate numbers of leukocytes (400x). t. Normal tracheal mucosa from a control hamster (400x). u. Widespread, moderate to severe broncho-interstitial pneumonia (100x). v. Multifocal moderate broncho-interstitial pneumonia focused on terminal bronchioles (100x). w. Multifocal, mild interstitial pneumonia focused on terminal bronchioles (100x). x. Normal lung from a control hamster (100x). y,z. Clustering (Euclidean, complete) of animals based in viral titers in lung and trachea and quantitative assessment of pathology in the upper and lower respiratory tract on 1 DPI and 4 DPI. Heatmap colors refer to color scale on the right, grey = NA. Exposure route is indicated by color bar at the top.

 

4DPIまでには,播種経路にかかわらず,すべての動物の肺から感染性ウイルスを検出することができた.エアロゾルまたはfomitesに曝露した動物の間には有意差は認められなかった(Figure 1d; N= 4, ordinary two-way ANOVA, その後のTukey多重比較検定, それぞれp= 0.4114およびp= 0.9201).播種経路にかかわらず,すべての評価されたハムスターにおいて,鼻甲介および肺のどちらの病理学的重症度の増加が観察された.興味深いことに,エアロゾル播種とI.N.播種のどちらの経路においても,鼻甲介内の嗅上皮領域がより重症化しており,ウイルスが最初に線毛上皮に付着して複製し,その後,疾患進行中により尾側の嗅上皮を標的にしていることが示唆された(FIgure 3m, n, o.この時点で,すべてのfomites播種動物で鼻粘膜病理が観察された.しかし病理重症度はI.N.群やエアゾール群に比べて低く、主に線毛粘膜の領域に集中しており,エアロゾル群やI.N.群に比べて疾患の進行が遅れていることが示唆された.気管炎症はすべての播種経路で観察され,最小限〜軽軽度まで様々であった(Figure 3q, r, s).エアロゾル群およびI.N.群では,シリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2感染症[24]と同様の中等度の肺病変が4DPIで観察されたが(Figure 3u, v),fomites播種群では重症度が低く,一貫性のない病変が観察された(Figure 3w.病変は,終末細気管支を中心とし隣接する肺胞へ広がる中等度の気管支−間質性肺炎として特徴づけられた.間質性肺炎は,浮腫,フィブリンによる肺胞隔壁肥厚と中等度のマクロファージそしてより少ない好中球浸潤が特徴であった.肺病理では,最小限〜中等度までの病変が観察されたが,これは,一部のfomites曝露動物が4DPIで肺に高ウイルス量を示したという観察結果と一致している(Figure 3w).縦隔リンパ節,腸間膜リンパ節,食道,十二指腸,または結腸切片(データは示されていない)およびコントロール動物において,1DPIおよび4DPIで有意な病理組織学的病変は観察されなかった(Figure 3d, h, l, p, t, x).

1DPIおよび4DPI の両方で観察されたウイルス力価と関連させて肺病理パラメータ(細気管支炎,間質性肺炎,気管炎,線毛上皮および嗅上皮の病理)の階層的クラスタリングを用いると,気管において1DPIの呼吸器病理と気管および肺のウイルス量との間には明確な関係が存在し,一方で鼻上皮の病理はより遠方の関連であった(Figure 3y).注目すべきは,4DPIにおける肺のウイルス量は,間質性肺炎の発現と最も密接に関連していたfomites曝露動物は,1DPIでは未感染コントロール群と最もよく似ており,下気道への明確な病変を認めない線毛上皮病理,気管炎の存在のため,4DPIにおける別のグループとともにクラスタリングしていた(Figure 3z).このことは,fomitesによるSARS-CoV-2曝露は,気道内での複製速度の遅延を示し,気道内へのウイルスの直接的な深部沈着(エアロゾル播種)に比べて,4DPIでは重症度の低い肺病理をもたらすことを示唆している

Fomite SARS-CoV-2 exposure results in a delayed, reduced, and anti-inflammatory immune profile:

全身性免疫応答を調べるために,4DPIにサイトカイン特異的ELISAを血清に対して実施した(Figure 4a).発現パターンは,炎症性TNF-αおよび抗炎症性IL-4IL-10に関して曝露経路によって顕著に異なっていた.I.N.群とエアロゾル群のどちらも,非曝露動物と比較すると,4DPITNF-αレベルが増加したが,fomites曝露群ではレベルが低下した; I.N.群とfomites曝露群において,有意に血清レベルの差が認められた(N= 4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.0360).逆に,IL-4レベルは,すべてのグループで非曝露動物と比較して顕著に増加したが,最高レベルは,fomites曝露動物にみられ,非曝露群とfomites曝露群における差は統計的有意に達した(N= 4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.0109).血清IL-10の増加は,fomites曝露動物およびI.N.曝露動物でも観察されたが,エアロゾル曝露動物では減少が観察され,エアロゾル曝露ハムスターとfomites曝露ハムスターにおいて有意差が認められた(N=4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.0286).有意ではないが,血清INF-γレベルが非感染動物と比較すると,低下する傾向が観察された.血清IL-6レベルには有意差は認められなかった.

 

 

Figure 4: Exposure dependent SARS-CoV-2 acute systemic cytokine response, strength of humoral response and viral shedding profile.

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a. Violin plots with individuals and median of serum concentrations of key cytokines (interferon (IFN)-γ, tumour necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6, IL-4, and IL-10) on 4 days post inoculation (DPI). b. Violin plots with individuals and median of endpoint IgG antibody titres against SARS-CoV-2 spike ectodomain measured by ELISA in serum. ELISAs were done once. c. Respiratory and d. intestinal viral shedding of I.N., aerosol and fomite exposed hamsters. Median, 95% CI and individuals are shown. e. Peak shedding and f. cumulative (area under the curve (AUC) analysis) respiratory and intestinal shedding of I.N., aerosol and fomite exposed hamsters. Statistical significance was measured by Kruskal-Wallis test, n = 4 per group. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant. g. Correlation between cytokine levels, early shedding (2 DPI), peak shedding, peak weight loss, lung titers and pathology at 4 DPI. Significant correlations (n = 4 per group, Pearson-Spearman analysis, p < 0.05) are indicated with an asterisk and strength of correlation (R2) is depicted according to the colour bar on the right.

 

曝露経路にかかわらず,ELISAで測定したSARS-CoV-2スパイクを標的とした抗体の存在により,14DPIですべての曝露動物が血清反応を示した(Figure 4b).液性反応の大きさは曝露経路と関連していた.I.N.曝露では,fomites曝露と比較して,最も強く,有意に高い抗体反応が認められた(N= 4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.0209).I.N.曝露およびエアロゾル曝露動物の間には,有意差は観察されなかった.これらをまとめると,エアロゾル曝露と比較して,fomites曝露後において優位に抗炎症性免疫応答が発現し,より重篤な転帰から保護される可能性が示唆されたが,抗体応答は弱いが,実質的なものである

Viral shedding is exposure route dependent:

シリアンハムスターにおける伝播経路依存性SARS-CoV-2ウイルス排出パターンを理解するために,7DPI までは毎日口腔咽頭スワブと直腸スワブを採取し,その後は週3回スワブを採取した(Figure 4c, d).口腔咽頭スワブは呼吸器からのウイルス排出を測定し,直腸スワブは腸からのウイルス排出を評価する.ウイルス複製のマーカーであるウイルス sgRNA [27] は,少なくとも1日間は,すべての曝露動物の両方のスワブから検出された.曝露経路における呼吸器からの全体的なウイルス排出プロファイルを比較すると,異なるパターンが観察された.I.N.接種では,1DPIに始まる高ウイルス量が認められ,それは6DPIまで続き,その後sgRNAレベルが低下し始めた.エアロゾル播種群では,2DPIでウイルス排出ピークを迎え,その後すぐにウイルスのsgRNAレベルが低下した.対照的に,fomite曝露動物は,エアロゾル播種群およびI.N.播種群とは異なる排出動態を示し,5DPIで排出のピークに達するまで,複数日にわたってウイルスsgRNAの排出が増加した.I.N.群とfomite群では,個々の排出ピークが高くなる傾向がみられたが,有意差は認めなかった(Gig 4 e; N= 4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.8400).比較として,腸の排出は,グループ間に有意差は認めず,中央値より低いウイルス量を示した(N= 4, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, p= 0.1512)(Figure 4d, e).グループ間での個々の動物における排出プロファイルをみると,腸の排出は最大で3日間連続して観察されたが,ほとんどの陽性動物ではスワブからのsgRNAの検出は12日間連続して検出されただけであった.各曝露経路で発生した全体的なウイルス排出量を評価するために,14DPIまでの累積排出量(AUC: area under the curve)を比較した.エアロゾル曝露は,I.N.曝露およびfomites曝露と比較して,口腔咽頭スワブ中のウイルスRNAが全体的に少なかった(N= 4, Kruskal-Wallis 検定, その後の Dunn 多重比較検定, p= 0.0263).対照的に,ほとんどの(comutative)ウイルスsgRNAは,エアロゾル曝露動物の直腸スワブから検出された(Figure 4f).これらのデータを総合すると,疾患重症度は,感染後の持続時間や累積ウイルス排出量を示すものではないことが示唆される

Early shedding profile may predict disease severity and corresponding immune response:

曝露経路間で疾患プロファイルへの影響が異なることが観察されたので,次に,早期排出パターンを通じた疾患の予測可能性を調査した.免疫状態の測定値としてのサイトカイン反応(4DPI)は,早期排出(2DPI),排出ピーク,体重減少ピーク,4DPIにおける肺の力価および病理との相関に含まれていた(Figure 3g).肺ウイルス力価は,2DPIにおける口腔咽頭スワブから検出されたウイルスRNAの量と有意に正の相関を示した(Spearman相関検定,N= 12, p= 0.047).肺ウイルス力価は,上気道/下気道病理および体重減少と正の関係を示した.このことは,早期の時点での呼吸器ウイルス排出(疾患発現前)が急性疾患発現を予測する可能性を示唆している

血清IL-4IL-6およびIL-10レベルは,疾患重症度のパラメータとの有意な相関関係を示さなかった; しかしながら,明らかな負の相関関係がみられた.TNF-αは,IL-4およびIL-10レベルと負の相関を示した(Spearman相関検定, N= 12, それぞれp= 0.048およびp= 0.049).早期の直腸ウイルス排出と血清TNF-αレベルと嗅上皮病理(olfactory pathology)との間に正の相関が観察された(Spearman相関検定, N= 12, それぞれp= 0.0002およびp= 0.001)(Figure 4g).

Airborne transmission is more efficient than fomite transmission in the Syrian hamster:

ケージのウイルス性fomites汚染を調査するために,I.N.播種ハムスター1匹入れたケージの表面から7DPIまで毎日スワブを採取した(Sup Figure 1b, c).ウイルスgRNAはすべてのサンプルにおいて1DPIで検出可能であり,sgRNAは寝具サンプル7/887.5%)およびケージサンプル3/837.5%)において検出可能であり,2DPI8/8ケージ内の両方のサンプルにおいて検出可能であった.ウイルスsgRNA7DPIまで高濃度で検出され,2DPI3DPIにピーク濃度が認められたことから,ケージ環境が強固に汚染されていることが示唆された

fomites感染の潜在的なリスクを評価するために,I.N.感染動物2匹を4日間収容した後,センチネル(sentinal)ハムスターをケージに導入した(Figure 5a).センチネル動物では病気の徴候や体重減少は観察されなかったが,汚染されたケージへの曝露の21日後(DPE: day after exposure)から8匹中4匹にseroconversionが認められ(Figure 5f),ハムスターからハムスターへのfomitesを介した間接的な感染が起こりうることが確認された(Figure 5h

Figure 5: Fomite and airborne transmission in the Syrian hamster.

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a. Experimental layout for fomite and b. airborne exposure experiments in hamsters. c. Pictures of smoke test to demonstrate unidirectional airflow in the transmission cage. d. Aerodynamic particle size distribution on either side of the transmission cage. e. Reduction of particles by the divider. f, g. Relative weight loss in hamsters after SARS-CoV-2 transmission via fomite and airborne routes. Lines represent mean ± SEM. h. Violin plot with individuals and median of endpoint IgG antibody titres against SARS-CoV-2 spike ectodomain by ELISA in serum of hamsters infected through airborne and fomite transmission route. ELISAs were done once. i. Respiratory shedding profile of hamsters exposed through fomite and airborne transmission routes, individuals, median and 95% CI are shown. j. cumulative (area under the curve (AUC) analysis) of respiratory shedding from animals which seroconverted after airborne and fomite transmission. Violin plots with individuals and median are depicted. Statistical significance was measured by Kruskal-Wallis test, n = 8 per group. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant.

 

次に,ハムスターからハムスターへの空気感染伝播効率とダイナミクスを評価した.この目的のために,空気の流れを許容するが,動物間の直接接触またはfomites伝播を許容しないようにケージの仕切りを設計した(Figure 5b, c, d, そしてsupplemental video).particle sizerを使用して,粒子の流れを遮断するcage dividerの効果を評価した.より小さい粒子(< 10μm)のcross-overが約60%遮断されたのに対して,より大きい粒子(> 10μm)は,センチネル側で85%を超えて現象したことが観察された(Figure 5d, e).

最初の実験では,センチネルハムスター1匹を,感染動物1匹(N= 8)からの仕切りの下流側に配置した.エアロゾル化されたウイルスに直接曝露された動物とは対照的に,センチネル動物のいずれにおいても,疾患の徴候および体重減少は観察されなかった(Figure 5g).しかし,すべての動物はseroconversionした.方向性のある気流(directional airflow)の重要性を評価するために,気流に逆らってセンチネルを収容した感染伝播4組についても,空気感染伝播モデルを作成した(Figure 5b, c).気流に逆らって配置されたセンチネル動物のうち,4組のうち1組だけがseroconversionしたことから(Figure 5g),予想通り,方向性のある気流が空気感染伝播の鍵であることが示唆された21DPI/DPEにおける抗体反応を比較すると,ドナーであるI.N.接種動物と,空気感染伝播後にseroconversionした動物との間に有意差はなく(100%),一方で,fomites感染伝播後にseroconversionした動物(50%)のウイルス力価は低かった(Figure 5g, Kruskal-Wallis検定, その後のDunn多重比較検定, N= 8およびN= 4, それぞれp= >0.9999およびp= 0.2488).力価は,直接播種後に観察されたものと同等であった.以上のことから,ハムスターからハムスターへの空気感染伝播は無症状の疾患発現を伴う可能性があるが,液性免疫メモリーは比較的強固であることが示唆された

fomitesあるいは空気感染伝播後の動物による感染伝播リスクを調査するために,呼吸器排出プロファイルを決定した.複数日連続で汚染されたケージに曝露した後,センチネルハムスター8匹のうち4匹でウイルス排出が確認された.ウイルス排出は1DPEで観察され,4/5DPEでウイルスsgRNAのピークが観察された.空気感染伝播については,気流下流のセンチネル動物は1DPEまでに排出を開始し,8匹すべての動物で2DPEまでに口腔内のウイルスsgRNAが高レベルで発現し,6DPEまで高レベルで維持されていた.このデータは,この間接曝露経路は,直接的なエアロゾル曝露とは明らかに異なる疾患発現と排出プロファイルを示すことを示唆している(Figure 5i注目すべきは,空気を介した曝露で感染した動物間における(commutative)ウイルス排出量は,fomites感染伝播した動物との差が認めなかったことである(Figure 5jこれらのデータは,疾患の表現型がないか,または非常に軽度である一方で,動物間におけるどちらの間接曝露経路でも,無症状キャリアの模倣が形成されることが示唆される

 

Discussion

ここでは,空気およびfomitesを介した曝露を模倣するように設計された自然感染経路を直接比較した.SARS-CoV-2の初期呼吸器トロピズムは曝露経路によって決定され,エアロゾル曝露は上気道と下気道の両方にSARS-CoV-2をより効率的に沈着させたその結果,SARS-CoV-2の複製動態は,I.N.播種動物と比較して,感染初期の気管および肺で高いウイルス力価を示した10倍低い播種量にもかかわらず,エアロゾル化したSARS-CoV-2をシリアンハムスターに曝露すると,肺でのウイルスの迅速な複製と体重減少がI.N.播種と比較して得られた対照的に,fomites播種では,曝露から肺でのウイルス複製までの時間が長くなり,疾患の発現が遅れ,疾患重症度が低下した.この遅延は,fomites感染の場合,ウイルス複製は吸入される前に口腔咽頭で起こる可能性があることを示唆している[32].このことは,全身的なTNF-α低下と,本研究で実証されたIL-4およびIL-10増加を特徴とする免疫応答の調節のための時間を与える可能性がある.これは,4DPIで観察されたウイルス力価がエアロゾル播種と比較して有意に低くないにもかかわらず、肺の免疫病理を減少させる可能性がある

エアロゾルに曝露すると呼吸器疾患が急速に進行するのに対し,大きな飛沫に曝露すると呼吸器疾患の顕著な特徴を有さず疾患経過が延長することがわかった[34, 35]これらの所見は,重症は下気道に直接ウイルスが沈着するのに対し,軽症は上気道で最初のウイルス複製が起こることが示唆されている

我々のデータは,疾患重症度と排出時間の間に明確な相関関係がないヒトでの知見を反映している.エアロゾル曝露動物は累積的にウイルス排出量が少なく,一方fomites曝露動物は,I.N.播種動物と比較して,同様に高いピークをもつウイルス排出量を示した.ヒトでは,血清学的分析により,感染の約17%は軽度から無症状のままであることが示唆されている [40].無症候性と症候性の両方の排出の証拠があり[41-44],軽症または無症候性感染は,より重症COVID-19症例と同じ感染リスクに寄与していることを示唆している[45,46].ヒトにおける無症候性感染は,より少ない排出量またはより速い減少を示すことがあるが[5]が,この動物モデルでは観察されなかった.

驚くべきことに,我々はここで,感染性ウイルスの排出ピークが減少している場合にも(8匹中4匹),fomites感染伝播が発生する可能性があることを示している.重要なことは,パンデミックの現段階での空気感染伝播の関与についての理解が深まったとしても,ヒトへのfomites感染伝播リスクを過小評価すべきではないということを示唆している.特に,院内感染は,院内感染とエアロゾル発生手技の組み合わせを呈する院内環境で発生する可能性が高く,より感受性の高い病院ではさらにリスクが高まる可能性がある.

感染していない動物から感染した動物に向かって空気の流れを逆にすると,感染伝播の急激な減少が観察された.このことから,SARS-CoV-2感染伝播には方向性のある気流が重要な役割を果たしていることが示唆された

 

 

References

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