COVID-19関連追加(2021224日)感染可能期間とウイルス培養

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2021111-2

2021124

【重症COVID-19患者の呼吸器サンプルにおけるSARS-CoV-2細胞培養複製の延長】

Folgueira MD, et al. Prolonged SARS-CoV-2 cell culture replication in respiratory samples from patients with severe COVID-19. Clinical Microbiology and Infection. Feb 22, 2021. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2021.02.014.

Objectives

本研究では,軽症COVID-19患者と重症両側肺炎を呈するCOVID-19入院患者の呼吸器サンプルを比較した.重症COVID-19では,呼吸器サンプルとペアとなる血清サンプルの中和活性も分析した.

Methods

臨床診断からフォローアップまでの様々な時期に患者189人から得られたRT-PCRSARS-CoV-2陽性の193サンプルについて細胞培養を行った無症状患者から得られたのは11サンプル軽症外来患者から得られたのは91サンプル重症入院患者から得られたのは87サンプルであった.これらの重症患者において,発症から10日以上経過した後に採取した呼吸器サンプルのペアとなる30血清サンプルでは中和活性を分析した

Samples and patients:

合計193個の呼吸器サンプル(鼻咽頭滲出液186個および気管支吸引液7個)をrRT-PCRE遺伝子)および細胞培養(Vero E6細胞)により処理した.すべてのサンプルは成人患者から得たものであった.COVID-19症状を呈し入院を必要としない91人の患者(初診または初回rRT-PCR陽性サンプル後のフォローアップのためにOccupational Health and Safety Serviceに通院している医療従事者(HCWs76を含む)(HCWn = 76))から91サンプルを得た.手術前または分娩スクリーニング,あるいは接触者調査における無症状感染者11から11サンプルを得た.重症肺炎のCOVID-19入院患者87から91サンプルを得た.重症COVID-19の診断は,呼吸状態,検査所見,および放射線画像所見によって確立された.サンプルは,臨床診断から入院中のフォローアップまでの様々な時点で採取した.集中治療室(ICU)に入院した患者のフォローアップ中に気管支吸引液を採取した.

Microbiological methods:

鼻咽頭サンプルは,universal transport mediumUTM)(Copan Diagnostics, Brescia, Italy)においてフロックスワブを用いて収集した.E遺伝子3)を検出するための以前発表されたrRT-PCRプロトコルが,Panther Fusion HologicSan Diego, CA, USA)の自動分子診断プラットフォーム上で処理するために適応された11).このアッセイで得られたCt値は,研究全体を通して相対定量(relative quantification)の指標として使用した.細胞培養は,残渣試料のアリコート(250μL)をゲンタマイシンおよびアンホテリシンBで除染し,Vero E6細胞(ATCC CCL-81)上の24-well platesに播種し,L-グルタミンおよび10%ウシ胎児血清を補充したMedium 199で培養した.プレートを5%CO2下で5日間培養した.細胞変性効果(CPE: cytopathic effect)の発現を毎日調べた.SARS-CoV-2 CPE特異度(SARS-CoV-2 CPE specificity)は,市販の抗SARS-CoV-2 Nタンパク質(Rockland Immunochemicals, Inc.Limerick, PA, USA)を一次抗体として使用し,Alexafluor 488Abcam, Cambridge, UK)で標識したヤギ抗ウサギIgGを二次抗体として使用して,immunofluorescenceshell-vial technique)により確認した.CPE観察時および細胞培養インキュベーション期間(the cell culture incubation period)の終了時に,各ウェルから培養上清を回収し,rRT-PCRを行い,元のサンプルより3 Ct以上低い場合に陽性と確認した.細胞培養に関連するすべての手順は,バイオセーフティレベル3施設で実施した.

Specific anti-SARS-CoV-2 antibody detection:

重症COVID-19患者27について,発症から少なくとも10日後に採取した血清サンプルを,分析された呼吸器サンプルとペアにして調査した.合計で,30血清サンプル中のIgGおよび中和抗体の存在を,IgG anti-SARS-CoV-2 chemiluminescent immunoassay Abbott Laboratories)および中和アッセイ(neutralisation assays)を用いて分析した.中和活性を検査するために,SARS-CoV-2-pseudotyped recombinant vesicular stomatitis virus-expressing luciferase systemを使用した.ウイルス含有トランスフェクション上清は,感染性を0.5-1倍数に正規化され,96-well plates中で37℃,1時間,血清サンプル希釈液でインキュベートした.インキュベーション後,2×104 Vero E6細胞はウイルス-プラズマ混合物上に播種され,37℃で24時間インキュベートした後,細胞を溶解し,luciferase発現について分析された.log inhibitor versus normalised response curvesを設定した非線形回帰モデルを用いて,50%中和力価(NT50を計算した.

Data analysis:

人口統計データ,COVID-19重症度,発症から検査までの期間(STT: symptom onset to test time,感染時に免疫抑制療法を受けていたかどうか,Ct値,細胞変性効果(CPE)検出を分析した.血清サンプルのNT50中和活性は,ペアになった呼吸器サンプルのウイルス活性(viral viability)と相関していた.

Results

91サンプル(91/193, 47%)で細胞変性効果(CPE)が認められた軽症COVID-19 患者では,ウイルスの活性化(viral viability)は10日間まで維持された.重症COVID-19患者では,発症後32日間までウイルスの活性化が維持された.重症COVID-19患者では,中等量あるいは少量のウイルス量(Ct >26)のサンプルでも,軽症患者よりも高い割合で感染性ウイルスが認められた(32/75[43%] vs 14/63[22%])(P <0.01サンプルの10%3/30)では明確な中和活性(NT50 >1:1024)が存在するにもかかわらず,CPE陽性であることが観察された

Patient and sample descriptions:

無症状患者は平均52.9歳(range 22-76)で,45%5/11)が女性であった.軽症COVID-19患者は平均40.7歳(range 22-81)で,75%68/91)が女性であった.この平均年齢と性別の分布は,このグループに含まれるほとんどがHCWsであるという事実によるものである.重症COVID-19入院患者の平均65.2歳(IQR 17-94)で,34%が女性(30/87)であった.

重症COVID-19患者(平均7.5[range 3-27], 中央値6[IQR 4-10]に比べると,軽症患者は症状のためより早く受診した(平均3.2[range 1-10], 中央値3[IQR 2-3]; P <0.001).

重症COVID-19患者7人(7/87, 8%)がICUに入院し,機械式換気が行われた

全体で,両側性肺炎を呈した重症患者7人(7/878%)が死亡し,両側性肺炎から回復した患者よりも年齢中央値が高かった(80.0 vs 64.5, P< 0.01

重症COVID-19患者18人(18/87 , 21%)は,感染した時点で免疫抑制治療が行われていた(12人は悪性腫瘍,3人は固形臓器移植患者,3人は自己免疫疾患があった)

患者群全体では,臨床診断時に109サンプルが得られ,そして患者のフォローアップ中に73サンプルが得られた.Ct値中央値は,入院患者の最初のサンプル(n= 63)で29.2IQR 26.0-32.3),外来患者(n= 46)で25.2IQR 21.5-29.1)であった(P= 0.007).死亡した7人の患者は,診断サンプルのウイルス量が他の肺炎患者よりも高かった(Ct値中央値 21.0 vs 29.5, P= 0.009対照的に,免疫不全患者からの最初のサンプルは,他の肺炎患者と比べて,有意に低いCt値を示さなかった(27.0 vs 29.5, P= 0.2

Cell culture:

91サンプル(91/193, 47%)の細胞培養においてCPEが認められ,ほとんどの場合72時間で検出可能であった(Figure 1.最初のサンプル(initial samples)では,フォローアップのサンプルよりも高い割合でウイルス複製が認められた: 69%75/109 vs 15%11/73)(P< 0.001).最初のサンプルの平均採取期間(collection time)は5日(range 1-20, 中央値3, IQR 2-7)であったのに対して,フォローアップのサンプルでは18.8日(range 10-32, 中央値20, IQR 10-25)であった.

 

 

Figure 1: CPE produced by SARS-CoV-2 on Vero E6 cell line. (A) Normal appearance of the cell line. (B) CPE development after 48 hours’ incubation. (C) Confirmation of the specificity of the CPE observed by shell-vial technique. Microscopic visualisation at 20x magnification.

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各患者群について,ウイルス複製を呈したサンプルの割合を,他のサンプルデータおよび患者人口統計とともに,Table 1に示す.

Table 1: Main patient and sample data for all patient groups.

 

Correlation between virus viability and time from symptom onset:

外来患者では,発症後1週間で得られたサンプルの71%17/24)でCPEが認められた軽症COVID-19患者では,フォローアップ期間におけるCPE陽性サンプルの最大STTsymptom time to test)は10であった

重症COVID-19入院患者では,1週目,2週目,3週目に得られたサンプルのそれぞれ59%16/27),56%9/16),64%7/11で活性化ウイルス(viable)が認められ,3週目以降STTでは25%2/8で活性化ウイルスが検出された重症COVID-19CPE陽性サンプルの最大STT32であった

Figure 2は,発症後の採取週別に分析したサンプルの分布,軽症/重症患者群の各週におけるCPE陽性サンプルの割合,およびそれらの統計的有意性を示したものである.

 

 

Figure 2: Distribution of samples according to symptom time to test (STT) in weeks (A) and percentage of samples with CPE according to STT (B) in groups of patients with severe and mild COVID-19.

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Correlation between virus viability and viral load (Figure 3):

軽症および重症COVID-19群のいずれにおいても,ウイルス複製を示したサンプルは,活性化ウイルス(viable virus)が存在しないサンプルに比べて,有意に低いCtを示した(軽症COVID-19では,それぞれ36.4 [IQR 31.8-39.1] vs 23.3 [IQR 20.5-28.0] ; 重症COVID-19では,それぞれ33.0 [IQR 30.4-38.0] vs 27.7 [IQR 23.2-30.0] ; P <0.001).

両群ともウイルス量が多いサンプル(Ct 25)では,90%を超える割合で活性化ウイルスを認めたしかし,割合はかなり低かったが,ウイルス量が少ないサンプル(Ct 35)でも,活性化ウイルスを検出した(軽症COVID-19では5%,重症COVID-19では15%外来患者と入院患者の間のウイルス活性化能力(viral viability)の差は,中等量あるいは少量のウイルス量(Ct 26)を有するサンプルで劇的なものであった重症COVID-19患者は,外来患者(18%, 7/38)よりも有意に高い割合(47%, 24/51)で感染性ウイルスが認められた(P <0.01

この点で,Ct値中央値が35.0IQR 32.6-38.9)であったにもかかわらず,7気管支吸引液サンプルのうち2サンプルがCPEを示したのは注目に値する

 

 

Figure 3: Percentage of samples with CPE according to the Ct amplification value (A) and the correlation of viral replication with Ct value and symptom onset (B) in groups of patients with severe and mild COVID-19.

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Correlation between viral replication and presence of anti-SARS-CoV-2 antibodies:

STT10日を超えて採取された重症患者の30血清サンプルのうち,12血清サンプルはCPE陽性の呼吸器サンプルと,18血清サンプルはCPE陰性の呼吸器サンプルとペアになった.

7血清サンプルでは,IgGおよび中和活性の存在が検出されず,そのうち5血清サンプルはCPE陽性の呼吸器サンプルとペアになっていた.残りのサンプルでは,どちらのアッセイも陽性であった.

NT50幾何平均中和抗体価とCPEの有無の間には有意差が認められた(107.2 vs 699.69, P= 0.04CPE陰性の呼吸器サンプルとペアになった血清サンプルのほとんど(16/18, 89%)がNT50 >1:80であったのに対し,CPE陽性の呼吸器サンプルとペアになった血清サンプルでNT50 >1:80であったのは5/1242%)のみであった(P= 0.032.この差は,CPE陽性の呼吸器サンプルとペアになった血清サンプル群の免疫不全患者の比率が高いことよるものではなかった(25%, 3/12 vs 11%, 2/18; P= 0.32).

1:1024を超える高中和抗体価は,サンプルのほぼ半数(14/30, 46.7%に認められたこのような中和活性にもかかわらず,ペアになった呼吸器サンプルの21%3/14)でウイルス複製が認められた

Discussion

ウイルス排出と感染性の持続時間の系統的レビューとメタアナリシス12)は,呼吸器サンプルにおけるRNA排出は長期化することがあるものの,疾患経過の9日を超えて活性化ウイルスは検出されないことを示している.これまでの研究5)7)では,重症COVID-19患者におけるウイルス排出の長期化と高ウイルス量との関係が示されている.我々は,低Ct値と活性化ウイルスの存在との間に有意な正の相関関係を観察したが,このウイルス量推定値は,感染性ウイルスを保持しているサンプルを識別するには不十分であるように思われる.異なるrRT-PCRアッセイで同じサンプルから得られたCt値が著しく変化する可能性を認識することが重要である13); したがって,Ct値とウイルス活性化能力(viral viability)の間の相関関係は,各アッセイとして決定するべきである.

長期にわたるウイルス複製の検出は,免疫不全患者で実証されている14); しかしながら,我々の結果は,中等量または少量のウイルス量であっても免疫不全患者では,以前の報告7)12)15)よりも,長期にわたってウイルス複製が認められる可能性を示している.この所見が,以前の報告7)に比べて,重症COVID-19患者における細胞培養陽性率(51.6%)が高いことに関連しているかどうか(SARS-CoV-2に対するcell lineの寛容性などの技術的要因による16))は,明確ではない.理想的には,ウイルスの活性化能力(viral viability)は,ヒト鼻咽頭上皮細胞培養(human nasopharyngeal epithelium cell)において測定されるべきである.

SARS-CoV-2の診断には,上気道からの異なるタイプのサンプルの使用が提案されている4).鼻腔上皮(nasal epithelium)にACE2受容体が最も高く発現することが示されており17),鼻咽頭滲出液がウイルスの活性化能力を調べるのに適した呼吸器サンプルであることが示唆され,これは本研究で分析した上気道サンプルタイプであった.

我々は,血清中和活性と細胞培養におけるSARS-CoV-2不活性(nonviability)との間に正の相関関係を見出した.それにもかかわらず,明らかな中和活性(NT50 >1:80)が示されても,重症COVID-19患者ではCPEが陽性であることが観察された.この高レベルの中和抗体が何らかの病原性の役割を果たしているかどうかは明らかではない18)19)

我々のシリーズでは,非常に高いNT50>1:1024)を示した患者2人がICU入院と人工呼吸を必要とした興味深いことに,この事実はSARS-CoV-1感染症患者においても報告されており,中和力価が急速に高くなると予後が悪くなることが示唆されている20)21)そして,これは最近ではSARS-CoV-2感染でも報告されている22)23).これらの明らかに矛盾する結果は,疾患重症度が異なる患者において,ウイルス複製と抗体の動態(kinetics),およびウイルス特異的T細胞応答を評価するための縦断的研究を行うことによってのみ説明できる.

Conclusions

軽症COVID-19患者では,上気道サンプルにおけるウイルス複製は短期間(最大STT, 10日間)であるが,重症COVID-19入院患者では,たとえ高レベルの中和活性が存在しても,上気道および下気道サンプルにおいて最大4週間という長期間にわたって活性化ウイルスの存在が確認されるというSARS-CoV-2活性化能力(viability)が全く異なることが示された.これらの結果から,重症の免疫不全患者が長期間にわたって活性化ウイルスを排出できることが示されたことを考慮すると,隔離予防措置の解除に関して重要な意味を持つ.軽症COVID-19については,検疫を少なくとも10日間に延長すべきである.

 

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