COVID-19関連追加(2021519-2

変異株とワクチンその8B.1.617B.1.618について)

【インドで同定されたSARS-CoV-2B.1.617およびB.1.618変異株スパイクタンパク質は,ワクチン誘発性抗体および治療用モノクローナル抗体に対して部分的な抵抗性を示す】

Tada Takuya, et al. The Spike Proteins of SARS-CoV-2 B.1.617 and B.1.618 Variants Identified in India Provide Partial Resistance to Vaccine-elicited and Therapeutic Monoclonal Antibodies. bioRxiv. Posted May 16, 2021.

https://doi.org/10.1101/2021.05.14.444076.

Abstract

最近インドで確認された伝播性が高い高いSARS-CoV-2変異株(B.1.617およびB.1.618)は,スパイクタンパクに変異があり,これが伝播性の向上に寄与し,再感染やワクチン誘発性抗体に対する耐性をもたらす可能性がある.B.1.617は,L452RE484QD614GP681R変異を持つスパイクタンパク質をコードしており,B.1.618のスパイクは,Δ145-146E484KD614G変異を持つ.これらの変異タンパク質によって疑似型レンチウイルスを作成し,回復期血清,ワクチン誘発性抗体,治療用モノクローナル抗体による中和に対する耐性を調べた.B.1.617およびB.1.618スパイクのウイルスは,回復期の血清およびワクチン誘発性抗体によって25倍の力価低下で中和されたE484QE484K24倍の力価低下で中和されたB.1.617スパイクタンパク質を持つウイルスは,L452R変異の結果として,Regeneron社のモノクローナル抗体カクテルで4.7倍の力価低下で中和されたワクチン誘発性抗体に対するスパイクタンパク質の中和抵抗性は控えめ(modest)であり,現行のワクチンはB.1.617およびB.1.618変異株に対して保護的であると考えられる

 

Main

Introduction

ここ数ヶ月,インドではSARS-CoV-2感染が劇的に拡大し,死亡率も上昇している.この感染拡大は,スパイクタンパクが変異した新たなSARS-CoV-2変異株B.1.617 [17]およびB.1.618http://cov-lineages.org)と関連している.B.1.617のスパイクタンパク質には,L452RE484QD614GP681Rの異がある[17]; B.1.618のスパイクには,Δ145-146E484KD614G変異がある.452番と484番の残基(residues)は受容体結合ドメイン(RBD: receptor binding domain)にあるため,免疫回避や抗体による中和に対する抵抗性に関与している可能性がある.Δ145-146は既知の抗体結合部位であるN-末端ドメインにあり[18]P681RS1/S2内にあり,タンパク質分解処理(proteolytic processing)に影響を及ぼす可能性がある(Figure 1A, B).いずれの変異がACE2との親和性を高め,抗体による中和に抵抗性を持つのか,また,これらの変異が伝達性を高める理由はよくわかっていない.

 

Figure 1: Infectivity of virus pseudotyped by B.1.617 and B.1.618 variant spikes.

(A) The diagram shows the domain structure of the SARS-CoV-2 spikes of B.1.617 and B.1.618. NTD, N-terminal domain; RBD, receptor-binding domain; RBM, receptor-binding motif; SD1 subdomain 1; SD2, subdomain 2; FP, fusion peptide; HR1, heptad repeat 1; HR2, heptad repeat 2; TM, transmembrane region; IC, intracellular domain.

(B) The 3D images indicate the location of the key mutations in B.1.617 and B.1.618 spikes. One representative RBD is shown in gray for simplicity.

(C) Expression vectors for the variant spike proteins, deleted for the carboxy-terminal 19 amino acids, were generated and used to produce pseudotyped viruses. Viruses were normalized for RT activity and applied to ACE2.293T cells. Infectivity of viruses pseudotyped with the individual mutations of the B.1.617 and B.1.618 spike protein or combinations thereof were tested on ACE2.293T (left) and ACE2.A549 cells (right). Luciferase activity was measured two days post-infection.

 

本研究では,B.1.617およびB.1.618スパイクタンパク質による疑似ウイルス型レンチウイルスを用いて,抗体抵抗性とACE2に対する変異型スパイクタンパク質の親和性の問題に取り組んだ.その結果,インド由来のウイルスは,回復期血清抗体やワクチン誘発性抗体による中和に対して部分的に抵抗性を示した.この耐性は,L452RE484QE484Kの各変異に起因するものであった.さらに,これらの変異株は,Regeneron社のCOV2療法を構成する2つのmAbのうちの1つであるREGN10933に対しても部分的に抵抗性を示した.

Results

Generation of B.1.617 and B.1.618 spike protein-pseudotyped lentiviruses:

B.1.617変異株スパイクタンパク質は,タンパク質分解処理部位付近のD614GP681R変異に加えて,RBDL452RE484Q変異を持つ(Figure 1A, B).B.1.618スパイクには,D614GおよびN末端の欠失Δ145-146に加えて,RBDE484Kが存在する(Figure 1A, B).我々は,B.1.617およびB.1.618スパイクタンパク質の,またそれぞれの点変異を持つスパイクタンパク質の発現ベクター(expression vectors)を構築し,これを用いてGFPおよびルシフェラーゼレポーターをコードするゲノムを持つ疑似型レンチウイルスを作製した.トランスフェクション(※核酸を動物細胞内へ導入する過程)を行った細胞と上清のイムノブロット解析から,変異スパイクタンパク質が発現し,タンパク質分解処理されていること,スパイクタンパク質が野生型D614Gと同程度のレベルでレンチウイルスビリオンに組み込まれていることがわかった(Supplementary Figure 1).バンド強度の定量化により,タンパク質分解処理部位の近くに位置するP681R変異は,S/S2の比が2倍減少することで測定されるように,タンパク質分解処理のわずかな増加を引き起こすことが示された.ACE2.293T細胞における各ウイルスの感染性を粒子数で正規化して解析したところ,B.1.617スパイクタンパク(L452R/E484Q/P681R)は感染性が2倍を超えて増加したのに対し,B.1.618は野生型D614Gと同程度の感染性を示した.個々の変異を解析した結果,B.1.617スパイクの感染性の増加はL452Rに起因するものであり,L452Rはそれ自体で3.5倍,E484Qとの組み合わせで3倍の感染性の増加をもたらした.その他の点変異は,感染性に大きな影響を及ぼさなかった(Δ145-146E484KP681R)(Figure 1C).ACE2.A549細胞を用いて疑似型ウイルスの同じパネルを解析したところ,各スパイクタンパク質の相対的な感染性には同様のパターンが見られ,全体として50倍の感染性の低下が見られた.

Neutralization of the Indian variants by convalescent sera and vaccine-elicited antibody:

抗体の中和に対するインド変異株の感度を調べるために,我々は変異株が出現する前に感染した回復期患者の血清検体を用いて,疑似型ウイルスパネルの中和試験を行った.その結果,B.1.617B.1.618スパイクをもつウイルスは,回復期血清による中和に対して,野生型と比較して,それぞれ2.3倍,2.5倍の抵抗性を示した.この結果は,南アフリカのB.1.351変異株の3倍の抵抗性と同様であった(Figure 2A).B.1.617の抵抗性は,B.1.351の場合と同様に,L452RE484Q変異に起因するものであり,B.1.618の抵抗性はE484K変異に起因するものであった.Δ145-146およびP681Rは中和抵抗性に有意な影響を及ぼさなかった.

Figure 2: Neutralization of spike protein variants by convalescent sera and antibodies elicited by BNT162b2 and mRNA1273 vaccine.

(A) Neutralization of viruses pseudotyped by B.1.617 (yellow) and B.1.618 (light blue) spikes (double, triple and single) by convalescent serum samples from 8 donors was tested. Each dot represents the IC50 for a single donor. The analyses were repeated twice with similar results.

(B) Neutralizing titers of serum samples from BNT162b2 vaccinated individuals (n=6) (left) and mRNA1273 vaccinated donors (n=3) (right) was measured. IC50 of neutralization of virus from individual donors are shown.

 

変異株のワクチン誘発性抗体による中和に対する抵抗性を調べるために,我々はPfizer社のBNT162b2ワクチンおよびModerna社のmRNA-1273ワクチン接種者の血清を用いて,変異スパイク疑似型ウイルスのパネルを中和する能力を調べた.その結果,ワクチン接種者の血清の方が全体の抗体価が約5倍高いことを除いては,回復期血清と同様の中和抵抗性パターンを示した.B.1.617は約4倍,B.1.618は約2.7倍の中和抵抗性を示した.この耐性は,B.1.617ではL452RE484QB.1.618ではE484Kに起因すると考えられた(Figure 2B).

Variant pseudotype neutralization by Regeneron REGN10933 and REGN10987 mAbs:

COVID-19に対するモノクローナル抗体療法は,疾患の症状を軽減し,入院を必要とする患者数を減らすことが示されている[19].しかし,スパイクタンパク上の抗体エピトープが変異によって変化した変異株に感染した患者では,この治療法の効果が低下するという問題がある.この問題を解決するため我々は,変異型ウイルスのパネルを中和するmAbの能力をテストした.その結果,B.1.617ウイルスに対するREGN10933の中和力価は,E484K変異株と同様に,約20倍に減少した(Figure 3A, D).Δ145-146およびP681Rは中和力価に影響しなかった.L452R変異があるウイルスとB.1.617に対するREGN10987の中和力価は約3倍に減少した(Figure 3B, D).REGN10933REGN10987の混合物の中和力は,B.1.617スパイクを持つウイルスに対する中和力価は4.7倍減少したが,B.1.618スパイクを持つウイルスに対する中和は変化しなかった(Figure 3C, D).

 

 

Figure 3: Neutralization of B.1.617 and B.1.618 spike protein variants by REGN10933 and REGN10987.

Neutralization of B.1.617 (left) and B.1.618 (right) pseudotyped viruses by REGN10933 (A) and REGN10987 (B).

(C) Neutralization of viruses pseudotyped by B.1.617 (left) and B.1.618 (right) spike proteins by 1:1 mixture of REGN10933 and REGN10987 was measured.

(D) The IC50 from REGN10933, REGN10987 and combination antibodies was shown.

 

B.1.617, B.1.618 have increased affinity for ACE2:

変異株の伝播性が明らかに増加しているのは,他の変異株で認められているように,ACE2に対する親和性が増加しているためであると考えられる.変異スパイクの相対的なACE2親和性を調べるために,ACE2結合アッセイ(ACE2 binding assay)を用いた.このアッセイでは,疑似型ウイルスを可溶性ACE2sACE2: soluble ACE2)でインキュベートした後,ACE2.293T細胞への感染性を,D614G変異を持つウイルスの感染性と比較して検証した.このアッセイによってN501Y変異株に対するACE2の親和性が6倍に増加したことが示されており,これは以前に報告された結果と一致している(Figure 4).その結果,E484Kの単独変異ではわずかな影響しか見られなかったが,L452Rを持つ変異株やE484QL452Rの組み合わせではより大きな影響が見られた.P681RとΔ145-146では影響はなかった.

Figure 4: Neutralization of B.1.617 and B.1.618 spike protein variants by soluble ACE2.

Viruses pseudotyped with variant spike proteins were incubated with a serially diluted recombinant soluble ACE2 (sACE2) and then applied to ACE2.293T cells. Each plot represents the percent infectivity of D614G (red) and B.1.617 and B.1.618 (blue) pseudotyped virus. The histogram at the bottom shows the calculated IC50 for each of the curves.

 

Discussion

B.1.617およびB.1.618スパイクを持つウイルスは中和に対して部分的に抵抗性を示し,回復期血清およびPfizer社とModerna社のmRNAワクチンによる誘発性抗体に対するIC50は,B.1617で平均3.9倍,B.16182.7倍減少した.この中和抵抗性は,L452RE484QE484Kの各変異によってもたらされた.これらの変異株の抵抗性の程度は,初期のB.1.351およびニューヨークのB.1.526E484K)変異株と同様であった.L452RおよびE484Q変異は,ACE2との結合親和性を高めており,これがこの変異株の伝播性を高めていると考えられる.いずれの変異株もREGN-COV2療法を構成する2つのモノクローナル抗体のうちの1つであるREGN10933に対して部分的に抵抗性を示し,B.1.617スパイクを持つウイルスは,REGN10987に対しても部分的に抵抗性を示したため,抗体カクテルの中和力価は4.7倍減少した.ワクチン誘発性抗体の中和力価が34倍に減少したにもかかわらず,平均力価は約1:500であり,これは初期の変異していないウイルスの感染から回復した人の血清で見られる力価をはるかに上回るものであったこのように,ワクチン接種者は,B.1.617およびB.1.618変異株に対して保護され続けると信じられる理由がある

カリフォルニア州のB.1.427/B.1.429に存在するL452R変異は,ワクチン誘発性抗体やモノクローナル抗体に対する抵抗性に大きな影響を与えることがわかった.この変異株は,感染者から2倍の増加をもって排出され,細胞培養でのウイルス感染性を高め,回復期およびワクチン接種ドナーの抗体の中和力価をそれぞれ46.7倍,2倍減少させることがわかった[20]B.1.351B.1.526P.1P.3のスパイクタンパクに存在するE484K変異は,初期のD614Gスパイクタンパクと比較して,中和に対する部分的な抵抗性を引き起こすことが示されている[11-16]B.1.617では,同じ位置の変異,すなわちE484Q変異によって,血清による中和が24倍に減少し,この残基が抗体認識のエピトープとして重要であることが示された.B.1.617furin切断部位のP681R変異は,B.1.1.7のスパイクタンパク質に見られるP681H変異と類似している.P681Rの出現により,ビリオン上の切断されたスパイクタンパク質の量が検出可能なほど増加した.この増加は,ACE2.293T細胞への感染性の増加とは関連していなかったが,in vivoにおける初代細胞への感染に影響を与えている可能性がある.

この研究の分析はmRNAワクチンに限定されているが,JohnsonJohnson社のように安定化された特有の(native)完全長スパイクタンパク質を発現するベクターワクチンが,ウイルス変異株の抗体中和に関して異なると考える理由はない.今回の結果は,現在のワクチンが,これまでに確認された変異株に対する保護効果を持つことを確信させるものである.しかし,今回の結果は,現在のワクチンに対してより抵抗性をもつ変異株が出現する可能性を除外するものではない.今回の結果は,個人を疾患から保護し,ウイルスの拡散を抑え,新たな変異株の出現を遅らせることができるワクチン接種を広く普及させることの重要性を示している.

 

 

Methods

Plasmids:

B.1.617 and B.1.618 spike mutations were introduced into pcCOV2.Δ19.D614GS by overlap extension PCR and confirmed by DNA nucleotide sequencing. Plasmids used in the production of lentiviral pseudotypes have been previously described [22].

Cells:

293T cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S) at 37°C in 5% CO2. ACE2.293T is a clonal cell-line that stably expresses a transfected human ACE2 as previously described. The cells were maintained in DMEM/1 μg/ml puromycin/10% FBS/1% P/S.

Human Sera and monoclonal antibodies:

Convalescent sera and sera from BNT162b2 or Moderna-vaccinated individuals were collected on day 28 following the second immunization at the NYU Vaccine Center with written consent under IRB approved protocols (IRB 18-02035 and IRB 18-02037). Donor age and gender were not reported. Regeneron monoclonal antibodies (REGN10933 and REGN10987) were prepared as previously described [21].

SARS-CoV-2 spike lentiviral pseudotypes:

Lentiviral pseudotypes with variant SARS-CoV-2 spikes were produced as previously reported [21]. Viruses were concentrated by ultracentrifugation and normalized for reverse transcriptase (RT) activity. To determine neutralizing antibody titers, sera or mAbs were serially diluted 2-fold and then incubated with pseudotyped virus (approximately 2.5 × 107 cps) for 30 minutes at room temperature and then added to ACE2.293T cells. Luciferase activity was measured as previously described [22].

Soluble ACE2 Neutralization assay:

Serially diluted recombinant soluble ACE2 protein [22] was incubated with pseudotyped virus for 30 minutes at room temperature and added to 1 × 104 ACE2.293T cells. After 2 days, luciferase activity was measured using Nano-Glo luciferase substrate (Nanolight) in an Envision 2103 microplate luminometer (PerkinElmer).

Immunoblot analysis:

Spike proteins were analyzed on immunoblots probed with anti-spike mAb (1A9) (GeneTex), anti-p24 mAb (AG3.0) and anti-GAPDH mAb (Life Technologies) followed by goat anti-mouse HRP-conjugated second antibody (Sigma) as previously described [22].

Quantification and Statistical Analysis:

All experiments were in technical duplicates or triplicates and the data were analyzed using GraphPad Prism 8. Statistical significance was determined by the two-tailed, unpaired t-test. Significance was based on two-sided testing and attributed to p< 0.05. Confidence intervals are shown as the mean ± SD or SEM. (*P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001, ****P≤0.0001). The PDB file of D614G SARS-CoV-2 spike protein (7BNM) was downloaded from the Protein Data Bank. 3D view of protein was obtained using PyMOL.

 

Supplementary Figure 1: Immunoblot analysis of spike protein in the cellular lysate and lentiviral particles.

Pseudotyped viruses were produced by transfection of 293T cells. Two days post-transfection, virions were harvested and analyzed on an immunoblot probed with anti-spike antibody and anti-HIV-1 p24. Cell lysates were probed with anti-spike and anti-GAPDH antibodies.

 

 

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