COVID-19関連追加(2021610日)SARS-CoV-2 RNAとヒト組織

Lancetcorrespondence),PNASより2編.

【軽症COVID-19後の肺組織におけるSARS-CoV-2 RNAの持続性】

Ceulemans LJ, et al. Persistence of SARS-CoV-2 RNA in lung tissue after mild COVID-19. Lancet Repiratory Medicine. June 9, 2021.

https://doi.org/10.1016/S2213-2600(21)00240-X.

2020121日,我々は,軽度のCOVID-19発症後105日目にSARS-CoV-2血清陽性のドナー(72歳女性,脳内出血で入院し死亡した.入院時鼻咽頭スワブPCRは陰性だったが,SARS-CoV-2 IgG陽性.3ヶ月前に自身は軽度のCOVID-19症状があったが,検査は受けていない.同時期に共に隔離された夫がCOVID-19で死亡.)からの両肺移植に成功した症例(61歳女性,COPD)を報告した1).繰り返し行ったドナーの鼻咽頭スワブの定量的(qRT-PCR解析は陰性であったが,この手法により,臓器調達時に採取した右肺のバイオプシーからSARS-CoV-2 N遺伝子のRNAdelta Ct 35)が検出された.この生検のウイルス培養は陰性で,ドナーからレシピエントへの伝播は起こらなかった.qRT-PCRの結果を裏付け,解釈するためには,complementary orthogonal methodsが必要であった.

そこで,同じ肺生検のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて,RNAscope技術によるultrasensitive single-molecule fluorescence RNA in-situ hybridisationを行い(appendix p1),その結果を,急性COVID-19の死亡患者の肺生検の結果と比較した(Figure A, B; appendix p2).ドナー肺生検の14枚のスライド(各5μm切片)を以下のように染色した: N遺伝子のプローブを5枚,S遺伝子のプローブを5枚,NSのプローブを4枚.SARS-CoV-2の代替宿主受容体(alternative host recipient)をコードすると提唱されているbasigin遺伝子のプローブは,NまたはSのみを染色した10枚のスライドでポジティブコントロールとして使用した2).その結果,Nプローブでは9枚のスライドのうち3枚,Sプローブでは9枚のスライドのうち6枚に,特徴的なRNAscope punctaが確認された(Figure C, D).これらのpunctaは,剥がれ落ちた物質の塊の中にあるように見え,この破片様組織(debris-like tissue)の中には、細胞も細胞核も見出すことができなかった.

Figure: Ultrasensitive single-molecule fluorescence RNA in-situ hybridisation with RNAscope.

鼻咽頭スワブの定量的RT-PCRが陽性となってから5日後に死亡したCOVID-19患者の肺生検のホルマリン固定パラフィン包埋切片(A, B).赤色のpunctaSARS-CoV-2 N遺伝子(A)またはSARS-CoV-2 S遺伝子(B)RNA,緑色のpunctaBSGbasigin)のRNAを示す.核染色DAPIは灰色で示した.スケールバーは20μm.肺のドナーから採取した右肺生検のホルマリン固定パラフィン包埋切片(C, D).赤色のpunctaSARS-CoV-2 N遺伝子(C),またはSARS-CoV-2 S遺伝子(D)RNA,緑色のpunctaBSGRNAを示す.核染色DAPIは灰色で示した.点線は,SARS-CoV-2 N遺伝子またはS遺伝子,およびBSGpunctaを含む破片様組織を持つ領域を示す.スケールバーは10μm

 

我々の知る限り,COVID-19から回復した免疫正常の患者の肺組織に,SARS-CoV-2 RNAが長期(> 100日)にわたって残存していたという報告は初めてである.SARS-CoV-2 RNAを含む破片様組織は,血管壁から剥離した変性内皮細胞,肺胞上皮細胞の異形の合胞体(dysmorphic syncytial elements of pneumocytes),あるいは間質に存在する好中球の死骸(dead neutrophilic plugs)などで構成されている可能性がある3)4).我々は,この破片様組織がSARS-CoV-2 RNAの分解を防いでいるのではないかと推測している.

喀痰,鼻咽頭スワブ,気管支肺胞洗浄液に関するデータによると,SARS-CoV-2 RNAが長期にわたって検出されることは稀で,数週間程度に限られることが示されている5).対照的に,SARS-CoV-2 RNAは,軽症COVID-19の経過において,発症後105日間にわたって肺実質に残存した.それにもかかわらず,移植から11ヶ月後の執筆時点で,レシピエントの健康状態は良好である.我々のデータは,このドナーの肺組織におけるSARS-CoV-2 RNAの残留が,取るに足らないもの(inconsequential)であったことを示している.

 

References

1) Ceulemans LJ Van Slambrouck J De Leyn P et al.

Successful double-lung transplantation from a donor previously infected with SARS-CoV-2.

Lancet Respir Med. 2021; 9: 315-318

2) Wang K Chen W Zhang Z et al.

CD147-spike protein is a novel route for SARS-CoV-2 infection to host cells.

Signal Transduct Target Ther. 2020; 5: 283

3) Bussani R Schneider E Zentilin L et al.

Persistence of viral RNA, pneumocyte syncytia and thrombosis are hallmarks of advanced COVID-19 pathology.

EBioMed. 2020; 61103104

4) Schurink B Roos E Radonic T et al.

Viral presence and immunopathology in patients with lethal COVID-19: a prospective autopsy cohort study.

Lancet Microbe. 2020; 1: e290-e299

5) Wölfel VM Corman W Guggemos M et al.

Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019.

Nature. 2020; 581: 465-469

 

 

 

 

 

 

 

【逆転写されたSARS-CoV-2RNAは,培養したヒト細胞ゲノムに組み込むことができ,患者由来の組織でも発現することができる】

Zhang L, et al. Reverse-transcribed SARS-CoV-2 RNA can integrate into the genome of cultured human cells and can be expressed in patient-derived tissues. PNAS May 25, 2021 118 (21) e2105968118.

https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118.

Significance

SARS-CoV-2感染症の未解決の問題点は,初感染から何週間も経過しても,ウイルス複製の証拠がないにもかかわらず,PCRで検出されるウイルスRNAが陽性である患者が多いことである.我々は今回,SARS-CoV-2 RNAが逆転写されて感染細胞のゲノムに組み込まれ、ウイルス配列と細胞配列が融合したキメラ転写産物(chimeric transcripts)として発現することを示した.重要なことは,このようなキメラ転写産物が患者由来の組織で検出されることである.我々のデータは,一部の患者組織では、すべてのウイルス転写物の大部分が統合された配列に由来することを示唆している.これらのデータは,SARS-CoV-2感染の結果についての洞察であり,患者が回復後もウイルスRNAを生成し続ける理由の説明に役立つかもしれない.

Abstract

COVID-19から回復した患者において,SARS-CoV-2 RNAが長期にわたって検出され,PCR陽性反応が再発することが広く報告されているが,これらの患者の中には感染性ウイルスを排出していない者もいるようだ.我々は,SARS-CoV-2 RNAが逆転写されて培養中のヒト細胞のDNAに統合され,統合された配列の転写が,患者に見られるPCR陽性反応の一部を説明する可能性を検討した.この仮説を裏付けるように,我々はSARS-CoV-2配列のDNAコピーが感染したヒト細胞のゲノムに組み込まれることを発見した.

その結果,ウイルス配列を挟むように標的部位が重複しており,統合部位にはLINE1エンドヌクレアーゼが認識するコンセンサス配列があることがわかった.

これは,LINE1レトロトランスポゾンを介した,標的を起点とした逆転写とレトロポジションのメカニズムと一致する.

 

※コンセンサス配列: DNARNA(あるいはタンパク質)中で,一定の機能に関与している領域に高い頻度で出現する塩基(あるいはアミノ酸)の平均的な配列.

LINE-1: 自らの DNA 配列を移動させる転移因子.長鎖散在反復配列(ちょうささんざいはんぷくはいれつ,英: long interspersed nuclear element, LINE)とは,自律的な転移機構をもつ非LTR型レトロトランスポゾンの一群である.

※レトロトランスポゾン: トランスポゾンつまり「可動遺伝因子」の一種であり,多くの真核生物組織のゲノム内に普遍的に存在する.レトロトランスポゾンは,自分自身をRNAに複写した後,逆転写酵素によってDNAに複写し返されることで移動,つまり「転移」する.DNA型トランスポゾン(狭義のトランスポゾン)が転移する場合と異なり,レトロトランスポゾンの転移では,DNA配列の複製が起こる.

 

また,一部の患者由来の組織では,ウイルス配列の大部分が統合されたDNAコピーから転写され,ウイルスと宿主のキメラ転写物を生成していることを示唆する証拠が見つかった.このように,ウイルス配列の統合と転写が,感染後や臨床回復後の患者におけるPCRによるウイルスRNAの検出に寄与していると考えられる.今回検出されたのは,宿主細胞のDNAに統合されたウイルスゲノムの主に3′末端に由来するサブゲノム配列のみであるため,統合されたサブゲノム配列から感染性ウイルスが生成されることはない.

Discussion

我々は,SARS-CoV-2の配列が逆転写され、培養中のヒト感染細胞のDNAに組み込まれるという証拠をここに提示する.統合されたうちの2つの細胞では、直接標的部位の繰り返し(20bpまたは13bp)(direct target site repeat)を含む”ヒト-ウイルス-ヒト”のキメラリードが回収された.また,LINE1エンドヌクレアーゼのコンセンサス認識部位が,ウイルス配列を挟む宿主DNAの両端に存在していた.これらのデータやその他のデータは,TRPTtarget primed reverse transcription)とretroposition integration mechanism(41, 42)と一致しており,内在性LINE1 RTが感染細胞のゲノムにおけるSARS-CoV-2配列の逆転写と統合に関与している可能性を示唆している.

 

TRPT: LINEは,レトロウィルスに近縁なLTR型レトロトランスポゾンが細胞質で逆転写を起こし転移するのとは異なり,核のDNAを直接標的として切断して,そこで逆転写を起こして転移する.このメカニズムをTPRTtarget primed reverse transcription)という.

 

培養細胞で解析したウイルスのインテグラントの約30%は,近くに認識可能なLINE1エンドヌクレアーゼの認識部位がなかった.このように,別のメカニズムで統合が起こる可能性もある.実際,LCMVに急性感染した細胞では,逆転写の際に内在性IAPエレメント(endogenous IAP elements[IAP: intracisternal A particle])とのコピーチョイスによって,キメラcDNAが作られるという証拠がある.このメカニズムでは,LCMVIAPの両方に相補的なキメラcDNAが作られると予想される.いくつかのケースでは,得られたキメラcDNAは,標的部位の重複を生じることなく統合された(29).また,最近の研究では,コロナウイルスの配列と内在性レトロトランスポゾンとの相互作用が,ウイルスの統合メカニズムである可能性を示唆している(40)

追跡調査では,患者の組織で宿主のゲノムに組み込まれたSARS-CoV-2の配列が存在することを証明することが重要であるだろう.しかし,ウイルス配列が陽性となる患者の組織における細胞はごく一部にすぎないと予想されるため,技術的に困難である(61).この考えと一致するように,培養または動物において,LCMVに感染したマウスの細胞1,000100,000個にわずか1個がゲノムに組み込まれたウイルスDNAコピーを持っていると推定されている(30).また,一部の細胞のDNASARS-CoV-2の配列が組み込まれているのは,患者のほんの一部にすぎない.しかし,世界中で14,000万人を超えるヒトがSARS-CoV-2に感染している(20214月時点)ことを考えると,稀な事象であっても臨床的に重要な意味を持つ可能性がある.また,感染した細胞は通常,サンプル採取前に死滅して失われるため,細胞培養アッセイでretro-integration eventsの頻度を推定することは困難である.同じ理由で,急性感染実験では,統合された細胞のクローン拡大は期待できない.さらに,ランダムな統合プロセスにより,異なる患者・組織で同じゲノム遺伝子座に統合される可能性は低いかもしれない.

細胞内にウイルスと宿主のキメラRNAが存在するだけでは,統合されたウイルス配列が転写されたことを示す強力な証拠とはならない.なぜなら,cDNAライブラリー調製の逆転写ステップでテンプレートの切り替えが起こる可能性があるからだ.一方,一部の患者から調製したRNA-seqライブラリーでは,一本鎖マイナス鎖SARS-CoV-2 RNAに由来する全ウイルスリードの割合,およびヒト-ウイルスキメラリードの割合が大幅に高くなっていることがわかった.レトロトランスポゾンを介した統合イベントでは,逆転写されたSARS-CoV-2 RNAの向きは,宿主遺伝子の向き(orientation)に対してランダムであるはずである.したがって,統合されたウイルス配列に由来するキメラRNAでは,キメラリードの約半分がプラス鎖宿主RNA配列とマイナス鎖ウイルス配列を結びつけることになるだろう.いくつかの患者サンプルでは,マイナス鎖のウイルスリードが全ウイルスRNA配列の4050%を占め,同様の割合のキメラリードにマイナス鎖のウイルスRNA配列が含まれていたことから,これらのサンプルのウイルスRNAのすべてではないにしても,大部分は統合型ウイルス配列に由来することが示唆された.

今回検出されたのは,宿主細胞のDNAに統合されたウイルスゲノムの主に3′末端に由来するサブゲノム配列のみであり,そのような統合されたサブゲノム配列からは感染性ウイルスは産生されないことに注意する必要がある.SARS-CoV-2の配列がヒトゲノムに統合され,キメラRNAの形で発現する可能性があるということは,今後の研究のためにいくつかの問題を提起している.統合されたSARS-CoV-2配列は,患者の中でウイルス抗原を発現するのか,またそれらは疾患の臨床経過に影響を与えるのか?これまでに得られた臨床的証拠によると,患者の組織内でウイルスタンパク質を発現している細胞は,せいぜい免疫組織化学で検出できるレベルのごく一部にすぎないと考えられる.しかし,SARS-CoV-2の配列が組み込まれて発現した細胞が,感染がクリアされた後も生存し,ウイルス抗原やネオ抗原(viral- or neo-antigen)を提示した場合,感染性ウイルスを産生することなく,免疫を継続的に刺激することになり,一部の患者で観察されているように,防御反応や自己免疫などの症状を引き起こす可能性がある(62, 63).マウスの急性感染細胞のゲノムにLCMVの配列が組み込まれていることから,著者らは,このような配列の発現は”自然に作られたDNAワクチンの一形態である可能性がある”と推測している(30).抗原反応を引き起こすのに必要な抗原提示細胞の数は不明だが,ウイルス感染やサイトカインへの曝露によって低下したLINE1の発現が,患者の感染細胞のゲノムへのSARS-CoV-2の統合を促す可能性がある.より一般的には,ウイルスDNAの体細胞への統合は,自然感染の結果であり,デング熱,ジカ熱,インフルエンザウイルスなど,他の一般的な疾患を引き起こすRNAウイルスの影響にも一役買う可能性があることを示唆している.

今回の結果は,現在行われている抗ウイルス療法の臨床試験(64)にも関連する可能性がある.もしウイルスRNAの統合と発現がかなり一般的であるならば,ウイルス複製とウイルス量に対する治療法の効果を判定するために極めて感度の高いPCR検査に依存することは,ウイルス複製を完全に抑制する治療法の能力を必ずしも反映しない可能性がある.なぜなら,PCR検査は,感染性ウイルスではなく,ゲノムに安定的に統合されたウイルスDNA配列に由来するウイルス転写物を検出する可能性があるからである.

 

 

Figure 1: SARS-CoV-2 RNA can be reverse transcribed and integrated into the host cell genome. (A) Experimental workflow. (B) Chimeric sequence from a Nanopore sequencing read showing integration of a full-length SARS-CoV-2 NC subgenomic RNA sequence (magenta) and human genomic sequences (blue) flanking both sides of the integrated viral sequence. Features indicative of LINE1-mediated “target-primed reverse transcription” include the target site duplication (yellow highlight) and the LINE1 endonuclease recognition sequence (underlined). Sequences that could be mapped to both genomes are shown in purple with mismatches to the human genomic sequences in italics. The arrows indicate sequence orientation with regard to the human and SARS-CoV-2 genomes as shown in C and D. (C) Alignment of the Nanopore read in B with the human genome (chromosome X) showing the integration site. The human sequences at the junction region show the target site, which was duplicated when the SARS-CoV-2 cDNA was integrated (yellow highlight) and the LINE1 endonuclease recognition sequence (underlined). (D) Alignment of the Nanopore read in B with the SARS-CoV-2 genome showing the integrated viral DNA is a copy of the full-length NC subgenomic RNA. The light blue highlighted regions are enlarged to show TRS-L (I) and TRS-B (II) sequences (underlined, these are the sequences where the viral polymerase jumps to generate the subgenomic RNA) and the end of the viral sequence at the poly(A) tail (III). These viral sequence features (I–III) show that a DNA copy of the full-length NC subgenomic RNA was retro-integrated. (E) A human–viral chimeric read pair from Illumina paired-end whole-genome sequencing. The read pair is shown with alignment to the human (blue) and SARS-CoV-2 (magenta) genomes. The arrows indicate the read orientations relative to the human and SARS-CoV-2 genomes. The highlighted (light blue) region of the human read mapping is enlarged to show the LINE1 recognition sequence (underlined). (F) Distributions of human–CoV2 chimeric junctions from Nanopore (Left) and Illumina (Right) sequencing with regard to features of the human genome.

 

 

 

 

Figure 2: Evidence for integration of SARS-CoV-2 cDNA in cultured cells that do not overexpress a reverse transcriptase. (A) Experimental workflow. (B) Experimental design for the Tn5 tagmentation-mediated enrichment sequencing method used to map integration sites in the host cell genome. (C) A human–viral chimeric read pair supporting viral integration. The reads are aligned with the human (blue) and SARS-CoV-2 (magenta) genomic sequences. The arrows indicate the read orientations relative to the human and SARS-CoV-2 genomes as shown in D and E. Sequence of the viral primer used for enrichment is shown with green highlight in the read (corresponding to the green arrow illustrated in B). Sequences that could be mapped to both genomes are shown in purple. (D) Alignment of the read pair in C with the human genome (chromosome 15, blue arrow). The highlighted (light blue) region of the human sequence is enlarged to show the LINE1 recognition sequence (underlined) with a 19-base poly-dT sequence (purple highlight) that could be annealed by the viral poly-A tail for “target-primed reverse transcription.” Additional 5-bp human sequence (GAATG, blue) was captured in read 2 (C), supporting a bona fide integration site. (E) Alignment of the read pair in C with the SARS-CoV-2 genome (magenta). The viral primer sequence is shown with green highlight. (F) Summary of seven human–viral chimeric sequences identified by the enrichment sequencing method in the two cell lines showing the integrated human chromosomes, LINE1 recognition sequences close to the chimeric junction, and human genomic features at the read junction.

 

 

 

 

Figure 3: Negative-strand viral RNA-seq reads suggest that integrated SARS-CoV-2 sequences are expressed. (A) Schema predicting fractions of positive- or negative-strand SARS-CoV-2 RNA-seq reads that are derived from viral (sub)genomic RNAs or from transcripts of integrated viral sequences. The arrows (Right) showing the orientation of an integrated SARS-CoV-2 (magenta) positive strand relative to the orientation of the host cellular gene (blue). (B) Fractions of SARS-CoV-2 sequences integrated into human genes with same (n = 15) or opposite (n = 13) orientation of the viral positive strand relative to the positive strand of the human gene. A total of 28 integration events at human genes with LINE1 endonuclease recognition sequences were identified from our Nanopore DNA sequencing of infected LINE1-overexpressing HEK293T cells (Fig. 1A). (C) Fraction of total viral reads that are derived from negative-strand viral RNA in acutely infected cells or organoids (see SI Appendix, Table S1 for details). (D) Fraction of human–viral chimeric reads that contain viral sequences derived from negative-strand viral RNA in acutely infected cells or organoids (see SI Appendix, Table S1 for details). (E) Fraction of total viral reads that are derived from negative-strand viral RNA in published patient RNA-seq data (autopsy FFPE samples, GSE150316, samples with no viral reads or of low library strandedness quality not included; see SI Appendix, Table S2 for details; reanalysis results consistent with the original publication). (F) Fraction of human–viral chimeric reads that contain viral sequences derived from negative-strand viral RNA in published patient RNA-seq data (autopsy FFPE samples, GSE150316; see SI Appendix, Table S2 for details). (G) Fraction of total viral reads that are derived from negative-strand viral RNA in published patient RNA-seq data (BALF samples, GSE145926; see SI Appendix, Table S3 for details). The red dashed lines in E–G indicate the level at which 50% of all viral reads (E and G) or viral sequences in human–viral chimeric reads (F) were from negative-strand viral RNAs, a level expected if all the viral sequences were derived from integrated sequences.

 

 

 

 

e2105968118.full
pnas.2105968118.sapp.pdf