COVID-19関連追加(2021617日)

口腔および唾液の感染について

【口腔および唾液のSARS-CoV-2感染】

Huang, N., Pérez, P., Kato, T. et al. SARS-CoV-2 infection of the oral cavity and saliva. Nat Med 27, 892–903 (2021).

https://doi.org/10.1038/s41591-021-01296-8.

Main

SARS-CoV-2は,COVID-19の原因ウイルスであり,世界保健機関(WHO)はこのウイルスを感染飛沫やエアロゾルに対する曝露を介した密接な接触により,無症候性,前症候性,有症候性者によって伝播する空気媒介性病原体として分類している1)2)SARS-CoV-2伝播は,発声,呼吸,咳,くしゃみ,さらには歌唱などの口腔内での活動によっても起こりうるが3)4)5),ほとんどの場合,感染の鼻腔-肺軸に注目が集まっている6)SARS-CoV-2が唾液腺(SGs)や粘膜などの口腔組織に直接感染し,複製するかどうかは依然として不明であるが,COVID-19感染者の約半数は,味覚消失,口渇,口腔病変などの口腔症状を呈している7)8)9).肺炎10)や炎症性腸疾患11)12)など,他の微生物関連疾患(microbial-associated diseases)で示唆されているように,これらの組織が初期感染部位であれば,唾液を介して肺や消化管にウイルスを感染させる上で重要な役割を果たす可能性があるため,この点は重要である(Extended Data Figure 1a

SARS-CoV-2は,ACE2TMPRSSファミリー(TMPRSS2およびTMPRSS4)などの宿主侵入因子(host entry factorsを利用しており13)14),これらの受容体を保有する細胞タイプを理解することは,全身の感染感受性を決定する上で重要である15)16)17)ACE2およびTMPRSS2の発現は口腔組織で報告されている18)19).しかし,口腔組織におけるウイルス侵入因子の発現に関する包括的な記述はなく,SARS-CoV-2感染を直接確認した例もない.我々は,口腔や中咽頭(oropharynx)のSGsやバリアー上皮がSARS-CoV-2に感染し,SARS-CoV-2伝播に寄与しているのではないかと考えた.これを検証するために,2つのhuman oral single-cell RNA sequencingscRNA-seqatlasesを作成し,SARS-CoV-2感染に対する細胞特異的感受性を予測した.その結果,SGsと口腔粘膜上皮においてACE2TMPRSSの発現が確認された.SARS-CoV-2感染は,剖検および外来患者サンプルを用いて確認した.無症候性COVID-19患者の唾液からは,ウイルス伝播の可能性が示された.前向きな臨床コホートでは,唾液ウイルス量(salivary viral load)と味覚消失との間に正の相関関係が認められた; 我々はまた,SARS-CoV-2 のヌクレオカプシドとスパイクタンパク質に対する唾液抗体反応(salivary antibody responses)が持続することを示した.

 

 

Results

Oral tissue atlases reveal resident immune cells and niche-specific epithelial diversity:

口腔や中咽頭(oropharynx)のSGsやバリアー粘膜は,ウイルスの感染,複製,伝播のゲートウェイとなる可能性が高い(Extended Data Figure 1a).口腔粘膜は層状扁平上皮で覆われており,角質化粘膜(歯肉と硬口蓋)と,非角質化粘膜(頬側,唇側,腹側舌と中咽頭)に分かれている20).背側の舌粘膜は味覚に適応しており,特殊な突起(乳頭 papillae21)がある; さらに,口腔全体は唾液で満たされており,下層の粘膜を保護している(Extended Data Figure 1b).

口腔組織のニッチ(niche: 各組織中に集中する場)の不均一性は,細胞レベルで認識されるようになってきている22)23)24)25); このことから我々は,SARS-CoV-2感染は,口腔部位によって一様ではないと予測した.我々はSARS-CoV-2感染が口腔内で一様ではないことを予測し,歯肉(n= 5; labial minor)と口腔粘膜(n= 4; gingiva/hard palate)という2つの部位を用いて,2つのhuman oral scRNA-seqデータセットを作成・統合し,ウイルス感染感受性を探るための初期データベースを構築した(Extended Data Figure 1c).腺と粘膜にはそれぞれ22種類と28種類の細胞が含まれており,構造的にも免疫細胞的にも幅広い不均一性が確認された(Figure 1a,b and Supplementary Table 1).

Figure 1: Single-cell atlases of distinct oral tissue niches reveal diverse immune and epithelial cells.

a,b, Using unpublished datasets, UMAPs of scRNA-seq data from dissociated (a) minor SGs and gingiva (b) delineate cell population contribution by sample and cell type annotation. We found 22 populations in the SG (7,141 cells) and 28 populations in the gingiva (6,683 cells). c–f, Distinct SG cell subpopulations were defined by a (c) dot plot expression matrix. Gene set (MSigDB) analysis for immune activation pathways (d) does not show clear enrichment, pointing to cells being in a resting/homeostatic state in the SGs. Gingival cell atlases were also defined by a dot plot expression matrix. f, Despite these biopsies coming from minorly inflamed gingival tissues (gingival index scoring an average of 1 out of 3), MSigDB analysis revealed minimal activation of T, natural killer and B cell populations. For gene lists related to a–d, see Supplementary Table 1. IFN, interferon; NK, natural killer; DC, dendritic cell.

 

 

Fig. 1

 

SGsの上皮コンパートメントには,漿液性腺房(LPOおよびODAM),粘液腺房(MUC5BおよびBPIFB2),管(S100A2およびWFDC2),管/基底上皮集団(KRT15およびSOX2),筋上皮(KRT14およびACTA2),神経内分泌細胞(CHGAおよびGFRA3)などの主要な細胞タイプが含まれていた(Figure 1c).イオノサイト(CFTRおよびFOXI1)は,肺からの報告26)よりも高い割合でSGに見られた; これらの細胞は分泌物のイオン組成を調節している.結合組織コンパートメントは,線維芽細胞(DCNおよびLUM),内皮−動脈(CLDN5),細静脈(AQP1)および毛細血管(CA4)−平滑筋(ITGA8)および周皮細胞(MYO1B)で構成構成されていた.免疫細胞の8つの異なる集団が特定され,高比率のIgA+形質細胞,Bリンパ球(MS4A1),Tヘルパー(Th)細胞(CD40LG),および2つの細胞傷害性Tcサブタイプ(T細胞(CD8A)−サブタイプ1EOMESおよびGMZA,消耗型[ehausted type])およびサブタイプ2SPRY1およびITAG1,組織に存在する記憶型[tissueresident memory type])で構成されていた.骨髄由来コンパートメントには,従来のDC2CD1C)の亜集団と,2種類のマクロファージ(タイプ1[CD163; M1]とタイプ2[FCGR3AIFNGR1CX3CR1; M2])が含まれていた.注目すべきことに,M2Tcも,遺伝子セット濃縮分析(enrichment analysis [Molecular Signatures Database (MsigDB)])を使用して活性化シグネチャを表示しなかったが,M2セルはCD86+TNF+であり、Tcサブタイプの少数はIFNG+であった(Figure 1d).

歯肉は,口腔全体の健康状態を示す指標となる12)27).健康な歯肉生検を用いて,粘膜アトラスは15の免疫亜集団の同定に寄与した(Figure 1e, Supplementary Table 1).樹状細胞では,従来の樹状細胞サブタイプ1XCR1)および2CD300E),活性化樹状細胞(CCR7+およびLAMP3 ref. 28),形質細胞樹状細胞(PACSIN1),上皮に存在するランゲルハンス細胞(CD207)など,5つの集団が同定された29)30)T細胞では、細胞傷害性T細胞(Tc; CD8A),ヘルパーT細胞(Th; CD40LG),制御性T細胞(Treg; LAIR2),γδT細胞(γδ; KLRC4),粘膜関連不変TMAIT)細胞(IL23R),およびサイクリングサブセット(cycling subset)(KI67)がカタログ化された.MAIT細胞の一部(約20-30%)はTNFを発現していた; サイクリングおよびTcクラスターの一部(〜30%)はIFNGを発現しており,CD95+Fas受容体)であることが判明した.これらの細胞はまた,免疫活性化プロファイルを示さず,休止/恒常性状態を示していた(Figure 1f31)32)

それぞれCXCL14KRT19COL7A1DSC2 / 3の濃縮された発現によって定義される,4つの基底上皮細胞集団(基底1-4)が発見された.KRT19を発現する細胞は,非角質化歯肉の”ポケット”上皮を定義している33).このデータセットでは,基底上細胞はまばらであった.COVID-19では,バリアー上皮は特に感染のリスクが高い.これらのデータは,多くの口腔バリアー細胞集団の中で,口腔上皮細胞の多様性が,ウイルス感染に対して複数の利用可能な標的を提供することを明らかにしている

Oral single-cell atlases predict viral infection of epithelial subpopulations:

SARS-CoV-2,その他のコロナウイルス(SARS-CoV-1HCOV-NL63MERS-CoVHCOV-229E),インフルエンザ,ライノウイルスCのウイルストロピズムを予測するために,我々はSGと歯肉のscRNA-seq atlasesの共同アノテーションを行った(Figure 2a, Extended Data Figure 2a , Supplementary Table 1).その結果,12の上皮細胞、7の間葉細胞,15の免疫細胞クラスターを含む34の固有の細胞タイプが同定された(Figure 2b).既知のウイルス侵入因子遺伝子の細胞タイプ別の発現を調べたところ,上皮集団の間でウイルス感染に対する幅広い潜在的感受性があることがわかった(Figure 2c-e16)17)34)35)SARS-CoV-1HCOV-NL63と同様に,SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質はACE2と結合し,組織特異的プロテアーゼ(TMPRSS2TMPRSS4TMPRSS11D)やエンドソームプロテアーゼ(CTSBCTSLBSGFURIN)によって活性化され,複製のためのエントリーを獲得することが報告されている36).これらの因子は多くのクラスターで広く発現していたが,ACE2TMPRSSメンバーを共通して発現していたのは上皮のみであった(Figure 2c).

Figure 2: An integrated oral cell atlas reveals broad epithelial infection susceptibilities.

a, To characterize the vulnerabilities of oral tissues to infection by SARS-CoV-2 and other common viruses, we integrated unpublished data from human oral gingiva and minor SGs. b, These 50 populations were jointly annotated before integration into 34 cell clusters to create the first human pan-oral cell atlas (see gene signatures in Extended Data Fig. 2a and Supplementary Table 2). These results illustrate that both shared and unique cell populations are represented in the gingiva and SG. c, Vulnerabilities to infection by coronaviruses, influenza and rhinovirus C can be predicted based on entry factor expression and visualized using expression matrices. Epithelia appear especially at risk for viral infection. d, When focused on the nine epithelial cell populations, vulnerabilities to SARS-CoV-2 were apparent in both SG and mucosa. These results strongly suggest that the oral cavity might be vulnerable to viral infection, especially for SARS-CoV-2. Expression matrices, including a low-frequency ACE2/TMPRSS2 co-expressing cells in Basal 1, ducts, mucous acini and myoepithelial clusters, further supporting SARS-CoV-2 infection susceptibilities. e, UMAPs demonstrate distinct cluster vulnerabilities, with ACE2 highest in most oral epithelia; however, expression of proteases demonstrated tissue-specific expression patterns with TMPRSS2 (enriched for SGs) and TMPRSS11D (enriched for mucosal cells). Endosomal proteases, CTSB and CTSL exhibited broad expression across vulnerable cell types. f, Normalized expression of epithelial clusters across oral, nasal and intestinal tissues demonstrate the relatively equivalent expression level of oral sites, especially in the minor SG. NK, natural killer; DC, dendritic cell; TA, transit amplifying.

 

 

figure2

 

SARS-CoV-2侵入因子の発現を解析したところ,単一の感染リスクが特異的な口腔上皮亜集団は見られなかった(Figure 2d).ACE2の発現は,基底1-3,基底サイクリング,SG管,SG漿液性,およびSG粘液腺房クラスターを含む9つの口腔上皮クラスターで検出された.これらの知見は,複数の口腔上皮細胞サブタイプが感染しやすいことを示唆している.SARS-CoV-2侵入因子の発現をUMAPUniform manifold approximation and projection)法で解析したところ,ACE2の発現は主にSGの上皮クラスターに限定されていた(Figure 2e).プロテアーゼは組織特異的な発現パターンを示し,TMPRSS2SG上皮に,TMPRSS11Dは粘膜ケラチノサイトに集中していた.エンドソームのプロテアーゼであるCTSBCTSLは,上皮全体で幅広い発現パターンを示した.

主な侵入因子であるACE2TMPRSS2の共発現は,鼻腔,肺,消化管での感染を予測するのに用いられてきた.ACE2の発現は上皮集団で検出された; しかし,SGsや粘膜の上皮細胞におけるACE2TMPRSS2の共発現は一般的には少なく,特にSG管や腺房,基底1集団(細胞の〜0.5%)で見られた(Figure 2d).ACE2TMPRSS2の相対的な発現を調べるために,口腔上皮細胞アトラスを鼻腔37)および腸38)scRNA-seq上皮細胞サブセットとさらに統合した(Figure 2f).これらの正規化された発現数から,口腔上皮,特にminor SGsは,SARS-CoV-2による既知の感染部位と類似していることが明らかになった.さらに,一般に公開されているGenotype-Tissue ExpressionGTEx)データ39)を用いると,minor SGsのウイルス侵入因子の発現レベルは,消化器および呼吸器部位全体を通して類似していることがわかった(Extended Data Figure 2b).また,ACE2TMPRSS2の発現量をプロットすると,肺,腸,腺の3つの部位で一貫して高い共発現が見られた(Extended Data Figure 2c).

我々は,SGと歯肉粘膜における受容体(ACE2)とプロテアーゼ(TMPRSS2TMPRSS4TMPRSS11D)の両方の発現を,in situ hybridizationISH)と免疫蛍光(IF)顕微鏡を用いて検証した(Figure 3a,b and Extended Data Figure 3a,b).これらの口腔内ISHの発現レベルは,鼻腔と同様である6)major SGsminor SGsの利用可能なバルクRNAシーケンス(RNA-seq)を使用して,異なるSG間でACE2TMPRSS2の発現を比較した.そしてminor SGsは耳下腺および顎下腺SGsと比較して高いACE2を発現した(Extended Data Figure 3ce).歯肉のISHでは,基底細胞に比べて基底上細胞でACE2TMPRSS2ファミリータンパク質の発現が相対的に高いことが示された(Figure 3b).

Figure 3: Oral and oropharyngeal ISH mapping supports oral infection by SARS-CoV-2.

a,b, Using healthy volunteer (a) gland and (b) gingival tissue sections, mRNA expression was confirmed using RNAscope ISH for ACE2, TMPRSS2, TMPRSS4 and TMPRSS11D in gingiva; (see TMPRSS11D in SG: Extended Data Fig. 3b); three independent replications for each. b, Owing to the known shedding/sloughing of suprabasal epithelial cells (c, illustrations), we examined both basal and suprabasal (SB) expression, revealing enrichment of all examined entry factors in suprabasal over basal cells. c, Using ISH, we mapped ACE2 and TMPRSS2, TMPRSS4 and TMPRSS11D in diverse oral tissues (buccal mucosa, ventral tongue and the dorsal tongue) and the oropharynx (soft palate and tonsils); three independent replications for oral and two replications for oropharyngeal samples. ISH controls are included in Extended Data Fig. 3f–h. This again supported the heterogeneity that can be found in the oral cavity—not only considering suprabasal over basal enrichment but also across sites. This mapping also revealed that all sites are vulnerable to infection in suprabasal cells that are shed/sloughed into saliva. Arrowheads in a–c indicate high gene expression (red). Scale bars (a–c), 25 μm.

figure3

 

口腔部位でのACE2 / TMPRSS2発現をさらにマッピングするために,頬粘膜,腹側/背側舌,軟口蓋,口蓋扁桃/舌扁桃からの健康な成人組織サンプルを使用してISHアッセイを実施した(Figure 3c and Extended Data Figure 3fg).各侵入因子において,基底コンパートメントと比較した場合,基底上発現の増加が観察された(Figure 3c and Extended Data Figure 3h).また,扁桃陰窩で多くのACE2発現が観察された.これらの結果から,SARS-CoV-2による感染の可能性がある部位は,口腔および中咽頭に複数存在することが示唆された

SARS-CoV-2 can infect and replicate in the SGs and mucosae:

我々は,18人の患者における28SG部位と6つの粘膜部位から採取したCOVID-19剖検組織コホートにおいて,SARS-CoV-2転写産物をdroplet digital polymerase chain reactionddPCR)で評価した(Supplementary Table 2).SARS-CoV-2は,SGs57%16/28; Figure 4a)で検出され,ペアの耳下腺SGsよりもminor SGsの方が,ウイルス量が多い傾向が見られた((n= 8 pairs, P= 0.0625, Wilcoxon two-sided signed-rank test; Extended Data Figure 4a).顎下腺へのSARS-CoV-2感染も2例で認められた40).口腔粘膜のライニング細胞(lining cells)へのSARS-CoV-2感染は,剖検患者(P11, P23)からの2セットの組織で観察され,5/6の粘膜部位(舌背,扁桃,口蓋垂)でddPCRによりSARS-CoV-2が検出された(Supplementary Table 2).

Figure 4: SGs are infected in patients with COVID-19 and exhibit robust immune responses.

a, ddPCR was used to investigate SARS-CoV-2 RNA in SGs: (minor (n=14), parotid (PG, n=8) and submandibular (SMG, n=2) (18 individuals and 28 glands) recovered from COVID-19 autopsies. N1 and N2 mean± standard deviation are displayed as appropriate for minor: 0.82 ± 2.0 and 0.86+2.1; PG: 0.10± 0.28 and 0.10 ± 0.26; and SMG: 0.34± 0.48 and 0.32± 0.46. b, c, Infection was confirmed using RNAscope fluorescence in situ hybridization (FISH) and IHC. Both minor (b) and parotid (c) SGs demonstrated SARS-CoV-2 in ACE2-positive ducts/acini (one independent replication). d–f, FISH and IHC detected SARS-CoV-2 infection and replication in the minor SG from (d) an acutely infected and (e) an autopsy SG using the spike (V-nCoV2019-S) and sense (V-nCoV2019-orf1ab-sense) probes, respectively (one independent replication). f, Spike IHC confirms patchy regional expression (zero independent replications). g, Immunophenotyping of autopsied SG was completed for CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, HLA-DR and granzyme B (GzmB); T cell responses dominate and are well correlated with sialadenitis. h, i, Representative immunophenotyping studies on (h) an acutely infected individual (CoV49) and (i) a COVID-19 autopsy (P8), demonstrating mild-to-moderate sialadenitis with focal lymphocytic sialadenitis and epithelial injury. Scale bars: b,c left, d and e, 25 μm; b,c right, 10 μm; f, 50 μm; h,i black, 500 μm; h,i white, 100 μm. A solid black box highlights the area enlarged in the inset. Experiments were completed on tissue sections from at least four separate individuals (five minor and four parotid). Where appropriate, summary data are presented as mean values ± s.e.m.

 

 

figure4

 

SGにおけるSARS-CoV-2の組織特異性を確認するために,COVID-19の剖検で採取したminor SGsおよび耳下腺SGsの組織切片を用いて,ACE2SARS-CoV-2のスパイクISHと免疫組織化学(IHC: immunohistochemistry)を完了した.SARS-CoV-2のメッセンジャーRNAmRNA)は,ACE2を発現している管や腺房に一貫して検出された(Figure 4b, c).しかし,SARS-CoV-2感染は局所的であり,一部の腺房ユニットは他のユニットと比較してより多くのウイルス転写産物の発現を示した.次に,管や腺房がSARS-CoV-2複製をサポートしているかどうかを調べた.COVID-19急性感染者や剖検例のminor SGsを用いて,感染した腺房と管がSARS-CoV-2の複製を保持していることを確認した(Figure 4d,e and Extended Data Figure 4b,c).これは,程度は低いが,耳下腺SGsでも確認された(Extended Data Figure 4c).感染(スパイク)と複製(センス)は,細胞ごと(per-cell basis)によく相関していた(Extended Data Figure 4d and Methods).

SGsにおけるウイルス感染の存在に対する不均一な炎症反応の特徴を明らかにするために(Figure 4f),急性感染したminor SGsおよび剖検SGsの免疫表現型解析と系統的顕微鏡解析を行った(Figure 4gi, Extended Data Figure 4e,f and Supplementary Table 2).最も一般的な組織学的特徴は,限局性リンパ球性唾液腺炎(FLS; Figure 4h, i)を含む慢性唾液腺炎であった.その他の調査結果には, 構造偏位,萎縮と線維化,粘液の注入(mucous inspissation),管の破裂などが含まれていた.免疫表現型では,COVID-19に罹患された他の組織で報告されているように(ref. 41)FLS症例では,比例してより多くのBリンパ球(CD20)を伴うTリンパ球性炎症(CD3)が優勢であることが明らかになった.HLA-DRの発現は,炎症や上皮の傷害部位に隣接していた42)これらの結果から,minorおよびmajor SGsは,感染,複製,および局所免疫細胞活性化の影響を受けやすい部位であることが立証された

これらの発見は,SARS-CoV-2の病因について2つの重要な問題を提起した.第一に,主要な侵入因子が口腔粘膜の基底上層に発現していることから,SARS-CoV-2はその場(in situ)で細胞に感染し,その後唾液中に排出される可能性がある(Figure 5a第二に,排出された感染細胞集団がSARS-CoV-2の結合部位となる,そして/あるいは,ウイルスの安定性と伝染性を促進するキャリアとして機能する可能性がある.これらの可能性を探るため,COVID-19CoV49; Figure 4)の急性感染者にISHを再度行ったところ,粘膜のすべての層で感染と複製が確認され,主に分化した上皮細胞に集中していることがわかった(Figure 5b.また,粘膜の擦過(scrapings)により,これらの細胞は脱落後も感染・複製能力を維持していることが示唆された(Figure 5c

Figure 5: Oral mucosal epithelial cells are infected by SARS-CoV-2 and shed into saliva.

a, We hypothesized that oral mucosae would be infected by SARS-CoV-2. b, Using the overlying mucosa from SG biopsy of CoV49 (Fig. 4), we performed ISH using spike/sense probes to demonstrate infection in basal, suprabasal (SB), and differentiated cells. Like the expression of SARS-CoV-2 entry factors (Fig. 3), replication was found more often in suprabasal layers (one independent replication). c, Mucosal scrapings from CoV49 confirmed infection and replication in cells fated to be shed into saliva (no independent replication). d,e, Salivary epithelial cells were found to express (d) all SARS-CoV-2 entry factors in a minority of cells (n=5 for ACE2 and TMPRSS11D; n=10 for TMPRSS2 and TMPRSS4). e, Scatter violin plots highlight percentage of expressing cells per sample from d, with means represented by a thick solid line (5.4, 2.8, 3.9 and 2.4; respectively). f–l, Salivary epithelial cells can sustain infection by SARS-CoV-2 using (f) ISH (one independent replication) or (g) IHC (no independent replication). h, Across saliva cells, there is infection heterogeneity of pCK cells (one independent replication). i, Using ten samples collected from outpatients with COVID-19, we confirmed that pCK cells are the primary infected cell population; red arrows point to individuals with loss of taste (n=10 with two independent replications; two-tailed paired t-test P=0.01). j, SARS-CoV-2 infection more often occurs in ACE2+ cells. Using 3D confocal microscopy, we demonstrated the virus inside of these cells, (k) most of which were ACE2+ (two independent replications). l, These epithelial cells were found to sustain viral replication inside the cells (two independent replications). The solid white line in b represents basement membrane; the white arrow in b represents differentiated cell trajectory. Dotted white lines (c, j and l) highlight cell membranes; the dotted green circle (h) indicates possibly CK+cell undergoing cell death; red arrowheads (h, j and l) represent SARS-CoV-2 infection, and green arrowheads (b and l) represent SARS-CoV-2 replication. DIC, differential interference contrast microscopy. Scale bars: b, h and l left, 25 μm; c, d, f, g, j and l right, 10 μm. Statistical test (i): **P0.001.

 

 

figure5

 

SARS-CoV-2陽性の軽度の症候性感染者から採取した唾液サンプルを用いて,SARS-CoV-2侵入因子の発現を解析した.ISHは,有核扁平上皮ケラチノサイトにおいて,ACE2の不均一性を示した; TMPRSS2TMPRSS4,およびTMPRSS11Dは,さまざまに表現された(Figure 5d,e and Extended Data Figure 5a,b).さらなる解析は,これらの細胞において,SARS-CoV-2スパイクの発現を検出した(Figure 5f, g).唾液には、上皮(pan-cytokeratin陽性[pCK+])および免疫(pCK-)集団の両方が含まれていることがわかった.10サンプルのコホート(Supplementary Table 3)を用いたところ,ISHによって,pCK+細胞でSARS-CoV-2シグナルが有意に多く検出され,SARS-CoV-2による口腔粘膜感染をさらに裏付ける結果となった(Figure 5h, i).また,3次元(3D)共焦点顕微鏡を用いて,唾液腺に存在する上皮細胞内にスパイクのシグナルが存在することを確認した(Figure 5j).このコホートでは,全唾液細胞の〜5-10%SARS-CoV-2に感染していることが判明した; ISHを用いると,感染細胞のほとんどがACE2を発現していることがわかった(Figure 5k).一般的には呼吸器管(respiratory tract)に存在するが、唾液中にはまれにpCK+ACE2を発現するSARS-CoV-2陽性の線毛細胞集団が認められ,唾液中のウイルス量のごく一部が呼吸器管からの寄与を反映していることが示された(Extended Data Figure 5c).注目すべきことに,脱落した上皮細胞の内部とその膜表面どちらにも,SARS-CoV-2スパイクが独立して局在していた.我々はまた,細菌とSARS-CoV-2がこれらの上皮細胞膜上で時折共に局在することも観察された(Extended Data Figure 5d).

脱落した口腔上皮細胞の細胞動態については,健康時および疾病時の研究はあまり行われていない12).これまでの報告では,健常者の唾液中の脱落細胞の〜50%が上皮性であることが示唆されていた43); しかし我々のデータによると,COVID-19感染者の脱落細胞の〜25%が上皮性であった(range, 4.0-39%).この減少は,感染に関連して脱落した上皮性細胞生存率の低下,そしてそれによって唾液中の免疫細胞集団が相対的に濃縮されたことを反映している可能性がある.まれではあるが,

形態が変化したpCKlow/SARS-CoV-2high細胞も観察された(Figure 5h, green circle).これらのpCKlow/SARS-CoV-2high細胞の一部は唾液中の免疫細胞集団である可能性があるが,ヒト唾液における好中球のUMAPsACE2/TMPRSS2を発現していない(Extended Data Figure 5e44)ISH3Dイメージングを用いると,唾液上皮細胞の内部でウイルス複製が検出された(Figure 5l).米国国立衛生研究所(NIH)の唾液サンプルを用いた同時解析でも,この所見が確認された(Extended Data Figure 5fh).

Saliva from asymptomatic individuals contains infectious virus:

我々の結果は,唾液中のSARS-CoV-22つの可能性を示唆している: 1つはde novoウイルスを作る感染腺からの無細胞画分,もう1つは排出され,感染した口腔粘膜からの細胞画分である.唾液中の無細胞性画分と細胞性画分の両方の感染性を調べるために,COVID-19患者から採取したウイルス量の多い唾液サンプル(n= 8; N1 Ct16-29)をVero細胞とインキュベートし,ウイルスの細胞変性効果(CPE: cytopathic effect)を調べた(Figure 6a, b and extended Data Figure 6a, b).完全な無症候性者の唾液にSARS-CoV-2 RNAが含まれていることを確認した後,上皮細胞から無細胞唾液を分離するために検体を処理した(Methods).無細胞唾液は,8サンプルのうち2サンプル(N1 Ct16および23)において,2日目からコロナウイルス感染症に典型的なCPE45)を誘発し,6日目にはより顕著になった.細胞画分はCPEを誘発した; しかし,これは6日目にのみ観察された(Figure 6a, b and Extended Data Figure 6a, b).複製を確認するために,CPEを示す単層とCPEの証拠がない単層から上清を収集し,新しいVero単層での感染を確認するために使用した.これらの培養は,親培養と同じ時間経過をたどった.これらの結果は,無症候性/前症候性COVID-19患者の唾液が感染性を有することを示している特に,これらの結果は,感染性ウイルスと感染細胞を含む排出された口腔飛沫が,SARS-CoV-2の空気媒介性伝播(airborne transmission)源となる可能性を示唆している

 

Figure 6: Viral infection kinetics and the antibody response in saliva samples of patients with COVID-19.

a,b, To test the infectiousness of saliva, (a) acellular and (b) cellular fractions of saliva from individuals with high viral load (n=8; Ct 1629) were incubated in duplicate on Vero cells to observe viral CPE. Supernatants were incubated with new Vero cultures in duplicate to demonstrate replication of the virus. Both acellular and cellular fractions demonstrated CPE in some (n=2) samples after 2 and 6 d, respectively; culture of supernatants elicited similar temporal dynamics as parent incubations (one independent replication). c,d, In a prospective, observational study, 39 NP-positive individuals with COVID-19 were grouped as having oral symptoms (with or without systemic symptoms), as having systemic symptoms only, or as being asymptomatic. Individuals demonstrated a heterogeneous disease course, with some requiring up to 13 weeks to clear detected virus in either the (c) nasopharynx or (d) saliva. Most asymptomatic individuals displayed only NP swab positivity, including two patients who developed symptoms during the prospective sampling (CoV12 and CoV13). e,f, Compared to healthy control saliva samples procured before the pandemic (n=7), the LIPS assay shows that saliva from a cohort of individuals with COVID-19 (n=32) contains antibodies to both (e) nucleocapsid and (f) spike viral antigens and occurred in 73% (22/30) and 54% (15/28) of samples, respectively. By week, the means ± s.e.m. are displayed to the right of each scatter plot as appropriate for nucleocapsid from weeks 1–7 (3.5 × 104 ± 1.2 × 104; 1.1 × 105 ± 4.8 × 104; 4.4 × 105± 1.8 × 105; 1.9 × 105± 8.4 × 104; 2.6 × 105 ± 9.0 × 104; 3.5 × 105 ± 9.1 × 104; 1.0 × 105± 2.5 × 104) and also for spike (1.8 × 104 ± 2.6 × 103; 2.2 × 104 ± 3.3 × 103; 3.7 × 104± 8.2×103; 4.2 × 104± 8.7 × 103; 4.7 × 104 ± 7.6 × 103; 5.7 × 104 ± 6.2 × 103; 3.3 × 104± 5.0 × 103). Fair to excellent agreement between presence of antibodies to viral antigens to nucleocapsid and spike was shown, respectively (Extended Data Fig. 6f). Horizontal dashed bar: (e and f) control light unit cutoff for positivity: mean plus 3 standard deviations. Scale bars (a and b), 100 μm. Ct, cycle threshold.

 

 

figure6

 

Levels of SARS-CoV-2 in saliva correlate with taste alterations:

無症候性および症候性COVID-19患者におけるSARS-CoV-2動態を研究するために,歩行可能者(n= 39)を2つのグループから登録した: 鼻咽頭(NP)スワブ陽性者(n= 30)または高リスク接触をもつ者(同居/職業曝露, n= 9; Extended Data Figure 6c, Supplementary Table 3 and Methods ).この試験では,5週間の前向き間隔(prospective interval)で,唾液およびNPスワブのSARS-CoV-2 RNAレベル,そして唾液中のウイルス抗原に対する抗体の存在を評価した.最初に陽性のNPスワブ検査からの時間に基づいて,これらのデータは過去に示されたように46)唾液とNPスワブが時間の経過とともに概ね良好な相関関係にあることを確認した(Figure 6c, d

SARS-CoV-2をクリアランスするまでに非常に長い期間かかった(最初の検査からNPおよび唾液検査が陰性になるまで2ヶ月を超える)者もおり,すべての真の無症候性感染者がウイルスを分泌物から迅速にクリアランスしたわけではない.この研究に登録された39人のうち,22%はまったく症状がないと報告しており,ウイルスクリアランスの範囲は0.5週間〜3.5週間であった(Extended Data Figure 6c).このコホートの平均クリアランス率は,症候性感染者より〜1週間低かったことから,一部の無症候性感染者は,長期間にわたって鼻咽頭や唾液中にSARS-CoV-2を保有している可能性が示唆された8人の無症候性感染者のうち,5人はNPスワブのみで陽性となった(そのうち2人はモニタリング期間の途中でウイルス量が陽性となった)2人の無症候性感染者(CoV01およびCoV02)は,NP検査陽性から14日後にNPウイルス量を照合したところ,唾液のみ陽性を示したこれらのデータは,ウイルスは鼻咽頭から排出されるが,唾液中には持続する可能性があることを強調しており,SARS-CoV-2が感染した口腔部位からウイルスが持続的に排出されていることを示唆している

症候性感染者では,唾液中のSARS-CoV-2 RNAの存在は,患者が自己申告した”味覚・嗅覚消失”と正の相関があった(X2: 4.92, odds ratio[OR]: 4.777[1.13719.977], P< 0.05; Figure 6d and Supplementary Table 3).これらのデータは,唾液の細胞感染実験(Figure 6b and Extended Data Figure 6b)において,唾液中のウイルス量が多く,味覚変化が報告された2人の患者がACE2発現細胞に有意な上皮(pCK+)細胞感染を示したことからも裏付けられている(Extended Data Figure 5g,h and 6d).”体の痛み/筋肉痛”の報告は,唾液中のウイルス量と逆相関していた(X2: 4.74, OR: 0.171 [0.0300.973], P< 0.05; Supplementary Table 3).サンプル数は少ないが,これらのデータは,唾液中のSARS-CoV-2 RNAの存在が味覚変化と正の相関関係にあることを示唆している

ユニバーサルマスクの使用や社会的距離の取り方などの公衆衛生対策は,飛沫やエアロゾル伝播を減らすことを目的としている.しかし,COVID-19患者のマスク着用による唾液の飛沫排出量の変化を直接測定しようとした研究はほとんどない(Methods).これらの人々における飛沫拡散を減少させるための標準的なマスク着用の効果を検証したところ,NPまたは唾液中のウイルス量が陽性である一部の無症候性感染者を含めて,排出された唾液飛沫の検出が10倍を超えて減少したことが示された(P<0.005; Wilcoxon two-sided signed-rank test)(Extended Data Figure 6e).

Virus-specific antibody kinetics in the saliva:

過去の報告では,唾液中のIgAおよびIgM抗体は急速に減衰し,IgG抗体は感染後15週間まで安定していることが示唆されている47).我々の前向きコホートにおいて,唾液IgG抗体は,COVID-19早期回復者において,ウイルス抗原であるヌクレオカプシドとスパイクに対して、それぞれサンプルの73%22/30)と54%15/28)で検出された(Figure 6e, f)(スパイク抗体はヌクレオカプシド抗体よりも遅れて発現した).唾液および血清中のヌクレオカプシド抗体とスパイク抗体は、それぞれ中程度(n= 10, kappa: 0.588, two-sided P= 0.0651)と強い(n= 9, kappa: 0.781, two-sided P= 0.0164)一致を示した(Extended Data Figure 6f).また,ヌクレオカプシド抗体とスパイク抗体の両方を持つ者の中には,鼻咽頭および唾液中のウイルスRNAが長期にわたり陽性で,中等度の症状と口腔組織感染を示す者もいた(example: CoV23 in Extended Data Figure g and CoV19 in Extended Data Figure 6e).これらのデータは,SARS-CoV-2感染が唾液中で持続的な局所免疫応答を引き起こすことをさらに裏付ける

Discussion

全体として,口腔は,SARS-CoV-2感染に適しているが,十分に認識されておらず,ウイルス伝播における直接的な役割については,さらなる調査が必要である.これに取り組むために,我々ははじめて,adult human oral scRNA-seq atlasを作成し,SARS-CoV-2の病因と伝播における口腔の役割を示唆する結果を得た.このアトラスは,主にSARS-CoV-2に焦点を当てているが,他の病原体やウイルスに対する感受性を調べるためにも使用できる.我々の取り組みは,細胞特異的SARS-CoV-2トロピズムを調べるためにscRNA-seqを用いるHuman Cell Atlasを中心とした共同研究と並行して行われ,COVID-19 Cell Atlashttps://www.covid19cellatlas.org/)が完成した.我々のアトラスや他のアトラスは,バリアー上皮(barrier epithelium)がSARS-CoV-2感染に寛容であることを示している15)16)

これまで,major SGsalivary gland)ウイルス感染に焦点が当てられてきた48)49)50); しかし,minor SGsをより詳細に解析すると,腺上皮(glandular epithelia)に主要な侵入因子が豊富に発現していることがわかった.我々のアトラスでは,minor SGs腺上皮の同じ細胞にSARS-CoV-2の侵入因子が発現するのは稀と予測していたが,我々は,ISHを用いるとより頻繁に発現することがわかった.その後の実験で、ACE2/TMPRSS2を発現している腺房上皮細胞や導管上皮細胞(acini and duct epithelial cells)にSARS-CoV-2トロピズムが広く確認されたことから,single-cell sequencingISHの両方が重要なツールであることが示された.さらに,minor SGsは,唾液産生のための機能ユニット全体でウイルスが検出されたにもかかわらず,ウイルス感染および複製のための比較的未調査の部位(relatively unexamined)と思われる.このことは,唾液におけるSARS-CoV-2の無細胞源(acellular source)がこれらの腺に由来するかもしれないというメカニズムを示唆している.この影響によって,SGsSARS-CoV-2感染を広げ,他の身体部位でCOVD-19を持続させる可能性が考えられる51)

我々のscRNA-seqアプローチの限界の1つは,他の上皮細胞亜集団に比べて基底上上皮細胞(suprabasal epithelial cells)の発現が少ないことであった(Figure 1, 2).基底および基底上上皮細胞において,SARS-CoV-2の主要な侵入因子の発現をISHマッピングした後(Figure 3),我々にとって,唾液中の感染上皮細胞を探すことが必須となった.基底上粘膜細胞(suprabasal mucosal cells)は,最終的には最も分化した組織層から脱落し,それは3時間に1回と推定される52); それらはまた,侵入因子の発現とSARS-CoV-2感染の証拠を維持していた(Figure 5).これらの細胞が常に排出されることで,口腔組織の感染に対する局所的な防御機構として機能している可能性があるが52),もしこれらの口腔上皮細胞が感染細胞を保持しているとすれば,体内の奥深くにある他の気道消化器組織ニッチを犠牲にすることになるかもしれない11)12).しかし,これらの細胞亜集団が高ウイルス量の唾液からex vivoVero細胞にウイルスを伝播させることは稀である.このように,唾液を介した口腔と他の体内部位とのつながりは,健康と疾患の両面において,まだ完全には解明されていない.

今回の結果は,SARS-CoV-2の感染拡大を完全に理解するためには,口腔部位と鼻咽頭(NP)部位の同時検査が必要であることを示している.さらに,今回の結果は,NPや唾液のみを用いた検査で偽陰性となることを一部説明できるかもしれない.しかし,これらの結果は,COVID-19の病因について新たな疑問を投げかけている; 1) これは,主として,口腔に感染を広げる”鼻腔先行(nasal-first)”感染かどうか2) 飛沫およびエアロゾルあるいはfomitesの摂取による”口腔先行(oral-first)”の可能性3) 感染パターンが疾患重症度や宿主の免疫応答に影響を与えるかどうか,などである.口腔伝播が鼻腔伝播に先行するかどうか,あるいは鼻腔伝播がなくても発生するかどうかを検証するためには,リスクのあるコホートを対象に,NP検査や唾液検査を用いた日常的なサーベイランスを含む研究を計画する必要がある.

口腔SARS-CoV-2感染と唾液による伝播のしやすさを考慮すると(Figure 6),無症候性,前症候性,症候性感染者の間でのウイルスの主な広がり方をさらに理解することが重要であるSARS-CoV-2の無症候性伝播は,このパンデミックの”アキレス腱”となっている53).また,口腔組織は末梢に位置し,頻繁に外部環境に曝露していることから,これらの組織がSARS-CoV-2の無症候性伝播に主要な役割を果たしている可能性があるこれらのことから,口腔がSARS-CoV-2伝播に積極的に関与している可能性が考えられる

 

References

省略.