COVID-19関連追加(2021623-2)ワクチンブレイクスルー感染についてその3

BNT162b2-mRNAワクチン接種者では,

SARS-CoV-2 VOCのブレイクスルー率が増加する】

Kustin, T., Harel, N., Finkel, U. et al. Evidence for increased breakthrough rates of SARS-CoV-2 variants of concern in BNT162b2-mRNA-vaccinated individuals. Nat Med (2021).

https://doi.org/10.1038/s41591-021-01413-7.

Abstract

BNT162b2 mRNAワクチンはSARS-CoV-2に対して非常に有効である.しかし,実験アッセイでのワクチン血清によるVOC B.1.1.7およびB.1.351の中和が低下していることから,VOCがワクチンによる防御を回避しているのではないかとの懸念がある(apprehension exists).我々は,ウイルスゲノム配列を用いて,Clalit Health Services(イスラエル)のBNT162b2 mRNAワクチン接種者の感染におけるVOCsの分布を調べるマッチドコホート研究を実施した.そして,もしVOCに対するワクチン有効性が低下した場合,ブレイクスルー症例におけるその割合がワクチン未接種の対照者よりも高くなるという仮説を立てた.鼻咽頭スワブから採取した813のウイルスゲノム配列を解析した結果,2回目接種後から少なくとも7日以降で陽性となったワクチン接種者は,対照者に比べてB.1.351に偏って感染していることがわかったまた,1回目接種後2週間〜2回目接種後6日までの間に陽性となった者は,B.1.1.7に偏って感染していたこれらの所見は,特定の時間帯(time windows)における両VOCsに対するワクチン有効性の低下を示唆している.今回の結果は,VOCsの拡散を防ぐために,ウイルス変異を厳密に追跡し,ワクチン接種を増やすことの重要性を強調するものである.

Main

Results

Study population:

イスラエル最大の医療機関であり,470万人の患者(人口の53%)が保険に加入しているClalit Health ServicesCHS)の会員の中で,SARS-CoV-2感染が証明されている相対的に稀なワクチン接種者(症候性または無症候性)を特定することから始めた.これらの対象者を,1回目ワクチン接種後14日〜2回目ワクチン接種後6日までにPCR検査が陽性となった者(dose1とする); そして,2回目のワクチン接種後7日以上経過してPCR検査が陽性となった者(dose2とする)2つのカテゴリーに分けた.この2つのカテゴリーの定義は,オリジナルのBNT162b2ワクチンの有効性に関する研究2)と,その後イスラエルで実施されたリアルワールドにおける有効性に関する研究1)にマッチさせて選択された.ワクチン接種者(症例)と,同様の日(±3日)に陽性となり,人口統計特性(年齢,性別,民族,地域)が類似しているワクチン未接種感染者(対照)をマッチングさせ,曝露の違いによるバイアスを低減した(Methods).我々は次に,PCRのために採取した鼻咽頭スワブからRNAを取得し,異なる対象者から採取したdose2−対照149ペア,dose1−対照247ペア,およびマッチしてもシーケンスが成功しなかった追加サンプルを含む813サンプルについて,完全ウイルスゲノムシーケンスを実施した(see below; Table 1, Supplementary Table 1 and Supplementary Figure 1).

Table 1:

Analysis of variant distributions:

我々は次に,各ウイルス配列について、系統を厳密に指定する方法を用いた(Methods).その結果,B.1.1.7B.1.351以外には,WHOが定義するVOCsあるいは変異株は検出されなかった(Supplementary Figure 2).そこで,B.1.1.7B.1.351以外の系統をすべて野生型(WT: wild type)と総称した.これらのWT系統はすべてD614G変異を有しており,世界中でこの変異の頻度が非常に高いこと一致している13).我々は,B.1.1.7あるいはB.1.351系統を決定するような変化ではない,その他の変化の存在が増えているという証拠を見つけることはできなかった.

B.1.1.7は,イスラエルでは全サンプリング期間を通じて優勢なウイルス株であり(712/813配列),時間経過とともに頻度が増加していた(Figure 1a).逆に,B.1.351は,ワクチン接種者と未接種者の両方を対象とした今回のサンプル(13/813配列)では,全体で1.6%の頻度であり(Figure 1b),これは20211月のイスラエルにおけるB.1.351の頻度に関する過去の報告16)と同様であった.

 

 

Figure 1: Variant frequencies of SARS-CoV-2-positive samples.

a, Variant frequencies across the time of the study, including the number of samples collected throughout the study. All values were calculated by averaging over a sliding window of 7 days. All samples sequenced in this study are included herein, including unpaired samples. b, Breakdown of variant frequencies based on the four groups of this study. The pie charts display the proportion of each variant (B.1.1.7, B.1.351 and WT) for paired vaccinated cases versus non-vaccinated controls separated by dosage (as defined in the main text), with cases on the left and their associated control on the right. Only paired samples are shown in the figure.

figure1

 

 

これまでの中和アッセイの結果から,我々は,B.1.1.7WTに比べてわずかにワクチン耐性があり,B.1.351B.1.1.7WTの両方に比べてよりワクチン耐性があるのではないかという仮説を立てた.この耐性の仮説のもと,B.1.351配列を除外して(潜在的なシグナルを不明瞭にしないため),まずB.1.1.7株について統計解析を行い,そしてB.1.1.7およびWT配列を合わせたもののと,B.1.351を比較した(Figure 2).我々は,不一致のペア(マッチした対照者と比較してワクチン接種者に異なる変異株が検出されたペア)を調べるために,ワクチン接種者と対照者のペアに対してMcNemar検定を行った.McNemar検定は,ここでの研究のように,各症例が対照とペアになっているレトロスペクティブコホートにおいて,ペアの比率(paired proportions)を比較するのに特に有用である.この検定の帰無モデル(null model)は,すべての変異株に対するワクチン有効性が等しいという仮説の下では,異なる変異株が不一致のペアに均等に分布するはずであるというものであった(see Figure 2 for a more elaborate explanation).

 

 

Figure 2: Results of matched vaccinated cases and non-vaccinated controls separated by effectiveness and VOC.

In each table, a cell reflects the number of pairs concordant (upper left and lower right) or discordant (upper right or lower left) for a given variant. The left panel focuses on the comparison between B.1.1.7 and WT (pairs with B.1.351 were removed), whereas the right panel focuses on comparing B.1.351 and either WT or B.1.1.7 (denoted collectively as ‘other’). Of note, the McNemar test focuses on a comparison of only discordant samples. Under a null hypothesis of equal vaccine effectiveness against all variants, we expect an equal number of discordant pairs in the upper right cell and the lower left cell, in each of the tables.

 

figure2

dose2症例とワクチン未接種対照者のB.1.1.7感染の不一致率(discordant rates)には,統計的に有意差は認められなかったが(McNemar odds ratio (OR) of 6:4; one-sided exact McNemar test, P= 0.38B.1.351の割合は,dose2症例とワクチン未接種対照者で有意に高かった(McNemar OR of 8:1; one-sided exact McNemar test, P= 0.02注目すべきは,dose2症例の約半数が2回目接種後7日〜13日で陽性となり,約半数が2回接種後14日目以上に陽性となったことである(Table 1しかし,B.1.351 dose2症例8人のうち7人は2回目接種後713日に,そして1人は2回目接種後ちょうど14日目に分離された(Figure 3

 

Figure 3: Breakdown of SARS-CoV-2 variant distribution during windows of weeks post vaccination.

The first three panels correspond to the dose1 group and the last three panels correspond to the dose2 group. The number of pairs and the isolation date range of the samples are noted for each panel. The dose2 B.1.351 case that is shown in the 14–20 days category was isolated exactly 14 days after the second dose.

Fig. 3

一方,B.1.1.7については,dose1症例とワクチン未接種対照者で有意に高い割合が認められた(McNemar OR of 26:10; one-sided exact McNemar test, P= 0.006dose1症例のB.1.351については,データが少ないため(各カテゴリーに1人ずつ),統計的な解析ができなかった(Figure 2).dose1症例のB.1.1.7のデータに対して条件付きロジスティック回帰を行ったところ(このカテゴリーではより多くのデータが得られたため),以前の解析結果を支持する結果が得られた: OR2.495%CI, 1.2-5.1).年齢は回帰解析に含まれており,有意ではない交絡因子であることが判明した.これは,特定のVOCへの感染傾向に対する年齢の役割が,我々のマッチングスキームによって補正されたことを示唆する.

Testing for biases and inclusion of missing data:

我々のサンプリングスキームが偏っているかどうかを検証するために,我々はイスラエルからの追加シーケンスと共にシーケンスしたすべてのサンプルの系統樹の再構築を行った.そして,ワクチン接種サンプルと未接種サンプルは,系統樹に沿って非常によく分散していることが確認された(Figure 4).このことから,サンプリングにおける強い偏りは除外できた.さらに,dose2症例B.1.3519サンプル(症例8, 対照1)に注目したところ,これらのサンプルはイスラエルの地理的に異なる7つの自治体から得られたものであることが分かった.イスラエルにおけるB.1.351配列の系統的な構造を調べたところ,ほとんどの配列が,分離日が20201228日〜202129日にある一つのcladeに属しており,したがって,このcladeのほとんどの配列は非常に類似していた(Supplementary Figure 5A).しかし,ほとんどのDose2症例配列のペアは,16個の変化で区切られていた(Supplementary Figure 5B).異なる自治体のデータと合わせて考えると,これらのdose2症例B.1.351配列が同じ直接感染伝播の連鎖の一部である可能性は低い(不可能ではないが)と結論づけられた.

Figure 4: A maximum-likelihood phylogenetic tree of Israeli SARS-CoV-2 samples including those sequenced herein.

Vaccinees are colored in violet or green, non-vaccinees are colored in brown, and black sequences are publicly available sequences from Israel (marked as ‘other’, Supplementary Table 2). Clades composed of the B.1.1.7, B.1.351 and WT sequences are encircled in blue, orange and gray, respectively.

Fig. 4

最後に我々は,1つのdose2症例と1つのdose1対照症例から成る2つのB.1.351配列について,マッチしたペアのシーケンスが成功しなかったことを指摘する(しばしば,Ct値が高い[ウイルス量が少ない]ことによることが多い).また,追加のdose1対照症例の配列も曖昧に分類された(Methods, Supplementary Figure 3).重要なこととして,これらの配列は,B.1.351に関する結論を変更しないか,あるいはdose2カテゴリーのB.1.351を支持するMcNemar ORを増加させ(Supplementary Figure 3),上述の結果を強化する可能性があるだろう.B.1.1.7に関しては,28のペアではない配列が見つかったが,これは対照症例や症例で信頼性のない配列があったためである.これらの配列は,B.1.1.7に関する結果の重要性を変える可能性があるが,この変異株で見られた傾向は変わらないだろう(Supplementary Figure 3).

 

 

Discussion

我々の結果は,2つの特定の時間帯(windows of time)に発生するワクチンブレイクスルー感染において,VOCsの割合が増加していることを示しているBNT162b2の完全接種者では,マッチさせた未接種対照者と比較すると,2回目接種後7日〜14日にB.1.351の割合が増加していたさらに,B.1.1.7の割合は,マッチさせたワクチン未接種の対照者と比較すると,1回目接種後14日〜2回目接種後6日までに,部分的ワクチン接種者で増加していたが,2回目接種から1週間以上経過して,B.1.1.7のブレイクスルー率が増加しているという証拠は見つからなかったFigure 2, 31回接種(dose1)カテゴリーにおけるB.1.351のワクチンブレイクスルーを評価するには十分なデータが得られなかった.これらの結果は,完全ワクチン接種者では,B.1.351に対する中和が大きく減少し,B.1.1.7に対する中和はほとんど減少しないことを示したin vitro中和アッセイの結果と概ね一致している7)8)9)10)11)17).全体的に見て,我々のデータは血清ベースの中和研究が,SARS-CoV-2の場合,実際の防御の良いプロキシになる可能性も示唆している(ref. 18).これは,より広範な方法で検証する必要があるが,新たなSARS-CoV-2 VOCが出現した場合,実戦的な研究を確立する前の迅速な第一段階として,中和研究が有効であることを示唆している.

我々のアプローチのパワーは,リアルワールドでの評価と,採用した厳格なケースコントロールマッチング戦略との組み合わせによるものである.これにより,ある変異株の高い割合が交絡効果によるものであることを除外することができた.例えば,ある都市でB.1.351のアウトブレイクが発生した場合,その都市で感染したワクチン接種者が誤って(spurious)特定されてしまう可能性があるが,ワクチン未接種者とマッチさせることで,この交絡効果を抑制することができる.しかし,ワクチン接種者の様々な行動上の影響など,他の交絡効果が存在し,それがコントロールされなかった可能性もある.さらに,シーケンスの限界により,VLが非常に低いサンプルのシーケンスを行うことができなかったため,今回の研究では,より高いVLを持つワクチン接種者に焦点を当てた.しかし,VLが低い症例は,症状が少なく,伝播リスクが低いことから,公衆衛生の観点からはより少ない懸念であることが示されている19).最後に,今回の2回接種(dose2)コホートは,2回目接種後7日以上経過してから記録された感染に基づいている(Table 1).このコホートの中には,ブーストによる免疫が完全に確立される前に感染した人がいる可能性があり,したがって,時間をかけて発展したブーストによる免疫の増強が,B.1.351変異株による感染をより効果的に予防する可能性がある20).注目すべきは,dose2群のB.1.351症例8人に注目すると,その全員が2回目接種後714日の間に目に陽性となり,2回目接種後14日より経過して陽性になった者はいなかったことである.この観察結果は、今回のコホートにおけるB.1.351の拡大は,主にワクチン接種後の限られた時間帯(time window)に起こることを示唆している.

本研究の主な注意点(caveat)は,WTB.1.351変異株の両方でサンプルサイズが小さいことであった.これは,202012月中旬にイスラエルで初めて検出されたB.1.1.7変異株の頻度(frequency)が劇的に増加し,本研究の期間中に全体の頻度(overall frequency)が約90%以上に達したこと(Figure 1a)と,本稿執筆時点でイスラエルにおけるB.1.351変異株の頻度が低かったことによるものである16).実際,20212月下旬〜3月上旬に採取した最新のサンプルでは,B.1.1.7変異株のfixationが認められたが,サンプル数が少ないため,この解釈には注意が必要である(Figure 1a).さらに,2つの理由から,得られたMcNemar ORsを過大に解釈しないよう注意が必要である: 統計的には必ずしもブレイクスルーのORを表すものではないこと; 特にB.1.351感染については,我々が認識した絶対数が非常に小さいこと.

今回の研究では,我々は感染を条件としたVOCsを観察しているため,我々の研究デザインは,両変異株に対するワクチン有効性を推測(deduce)するように意図されていない.言い換えれば,本研究では感染者のみに焦点を当てている; 非感染者は無視し,ワクチン接種者あるいは対照者の絶対的な感染率を測定していない.したがって,B.1.1.7株とB.1.351株に対するワクチン有効性については,慎重に推測するしかない.これまでのリアルワールド例では,イスラエルでCHS患者を対象に行われた大規模な研究で,2回目接種から1週間後からBNT162b2ワクチンの非常に高い有効性が示されている1).この研究の期間中,イスラエルではB.1.1.7が高い頻度で発生していたことから,この研究で観察された高いワクチン有効性には,この株に対する高い効果も含まれていたと考えられる.しかし,今回の研究では,初回ワクチン接種後の最初の数週間は,B.1.1.7に対する防御が低いことが示唆するかもしれない.一部の国では,BNT162b2ワクチンの1回目と2回目接種の間隔を,推奨されている3週間からそれ以上に延長することを選択しているため21),この遅延が,1回目のみの接種者のB.1.1.7株に対するワクチン有効性に影響を与えるかどうかを注意深く評価することが重要である.今回のデータでは,2回目接種後2週間では,B.1.1.7株あるいはB.1.351株のいずれのブレイクスルーの増加は観察されなかったが,この期間のデータは相対的に限定されることに注意が必要である(76, Table 1).今回の結果は,2回目接種から14日では,WTと比較して,B.1.1.7株およびB.1.351株に対するワクチン有効性がわずかに低下することを示した最近の結果22)と全体的に一致している.

我々は,ワクチン接種後の非常に特殊で異なる時間帯にB.1.1.7B.1.351のブレイクスルー率の増加が見られるのか,そのメカニズムを考察して結論とする.生物学的な観点からは,本研究で観察されたブレイクスルー症例は,これらの株に存在する特定の変化を媒介とした免疫回避(immune evasion, mediated by particular alterations present in these strains)によるものかもしれない9)23)24)25)26)27)あるいは,B.1.1.7Ct値が低く,VLが高いことが以前に報告されており3),これは2回目接種で増強される前に,ワクチンによって誘発されたあまり強くない免疫応答を克服するのに十分な可能性がある.今回の研究では,B.1.1.7感染では他の変異株と比較して高いVLは観察された(ref. 28)B.1.351感染では高いVLが観察され,ワクチン接種者ではワクチン未接種者と比較して低いVLが観察された(Supplementary Figure 629)30).これらの結果は暫定的なものであり,様々な行動バイアスの影響を受けている可能性があることを強調する.特に,イスラエルのワクチン接種者は,陽性患者に接触した後の検疫や検査が免除されており,このことが,検査を受ける時期や方法に影響を与えている可能性がある.さらに,症状の有無にも偏りがあり,ほとんどのワクチン接種者は,症状があるときにのみ検査を受けていたと考えられる.このような理由から,我々はコホートにおける症状の発生率の報告は控えた.

B.1.351の出現頻度が低いことを確認し,我々は安心した(Figure 1a16).注目すべきことに,B.1.1.7B.1351は,ワクチン接種が開始された12月下旬にイスラエルで初めて検出された.我々のサンプリングは流行上昇のピークの間,ワクチン接種率の上昇期に始まり,流行の縮小期に至った(Figure 1 and Supplementary Figure 4).このような複雑な動態から,我々は,イスラエルの特殊な環境下では,ワクチン接種率が上昇しているにもかかわらず、B.1.351変異株が選択されにくいと推測できるのみである.これは,B.1.351変異株が、主に2回目接種後7日〜13日の間に,ワクチン誘発性免疫を回避するその限定された能力によるかもしれないあるいは,進化の観点から,免疫回避の変容は,特に高い伝達性を持つB.1.1.7(ref. 3)と比較して,低下した伝播性の形でフィットネスを犠牲にしている可能性がある.イスラエルあるいは世界中のVOCsに作用する進化の圧力をさらに理解するためには,さらなる研究が必要である.この論文を改訂した20215月時点で,イスラエルでの感染者数は900万人の人口の中で1日あたり約35人と劇的に減少している(ref. 31).このことは,特定の時期にワクチンブレイクスルー感染がVOCsであるB.1.1.7B.1.351でより頻繁に起こる可能性がある一方で,2回の大規模ワクチン接種によってその拡散がコントロール・抑制されていることを示唆している.

References

1) Dagan, N. et al. BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine in a nationwide mass vaccination setting. N. Engl. J. Med. 384, 1412–1423 (2021).

2) Polack, F. P. et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615 (2020).

3) Davies, N. G. et al. Estimated transmissibility and impact of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 in England. Science 372, eabg3055 (2021).

4) Davies, N. G. et al. Increased mortality in community-tested cases of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7. Nature 593, 270–274 (2021).

5) Tegally, H. et al. Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa. Preprint at medRxiv

https://doi.org/10.1101/2020.12.21.20248640.

6) Naveca, F. et al. Phylogenetic relationship of SARS-CoV-2 sequences from Amazonas with emerging Brazilian variants harboring mutations E484K and N501Y in the Spike protein. Virological.org

https://virological.org/t/phylogenetic-relationship-of-sars-cov-2- sequences-from-amazonas-with-emerging-brazilian-variants-harboring-mutations- e484k-and-n501y-in-the-spike-protein/585.

7) Liu, Y. et al. Neutralizing activity of BNT162b2-elicited serum. N. Engl. J. Med. 384, 1466–1468 (2021).

8) Xie, X. et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike 69/70 deletion E484K and N501Y variants by BNT162b2 vaccine-elicited sera. Nat. Med. 27, 620–621 (2021).

9) Collier, D. A. et al. Sensitivity of SARS-CoV-2 B.1.1.7 to mRNA vaccine-elicited antibodies. Nature 593, 136–141 (2021).

10) Zhou, D. et al. Evidence of escape of SARS-CoV-2 variant B.1.351 from natural and vaccine-induced sera. Cell 184, 2348–2361.e6 (2021).

11) Wang, P. et al. Antibody resistance of SARS-CoV-2 variants B.1.351 and B.1.1.7. Nature 593, 130–135 (2021).

12) Kuzmina, A. et al. SARS-CoV-2 spike variants exhibit differential infectivity and neutralization resistance to convalescent or post-vaccination sera. Cell Host Microbe 29, 522–528 (2021).

13) Korber, B. et al. Tracking changes in SARS-CoV-2 spike: evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus. Cell 182, 812–827 (2020).

14) Liu, Y. et al. Neutralizing activity of BNT162b2-elicited serum—preliminary report. N. Engl. J. Med. 384, 1466–1468 (2021).

15) Tarke, A. et al. Negligible impact of SARS-CoV-2 variants on CD4+ and CD8+ T cell reactivity in COVID-19 exposed donors and vaccinees. Preprint at bioRxiv

https://doi.org/10.1101/2021.02.27.433180.

16) South African variant found in about 1% of all positive tests. MOH https://www.gov.il/en/departments/news/22022021-01.

17) Planas, D. et al. Sensitivity of infectious SARS-CoV-2 B.1.1.7 and B.1.351 variants to neutralizing antibodies. Nat. Med. 27, 917–924 (2021).

18) Khoury, D. S. et al. Neutralizing antibody levels are highly predictive of immune protection from symptomatic SARS-CoV-2 infection. Nat. Med.

https://doi.org/10.1038/s41591-021-01377-8.

19) Marks, M. et al. Transmission of COVID-19 in 282 clusters in Catalonia, Spain: a cohort study. Lancet Infect. Dis. 21, 629–636 (2021).

20) Walsh, E. E. et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. N. Engl. J. Med. 383, 2439–2450 (2020).

21) Optimising the COVID-19 vaccination programme for maximum short-term impact. GOV.UK

https://www.gov.uk/government/publications/prioritising-the-first-covid-19-vaccine-dose-jcvi-statement/optimising-the-covid-19-vaccination-programme-for-maximum-short-term-impact.

22) Abu-Raddad, L. J. et al. Effectiveness of the BNT162b2 Covid-19 vaccine against the B.1.1.7 and B.1.351 variants. N. Engl. J. Med.

https://doi.org/10.1056/NEJMc2104974.

23) Greaney, A. J. et al. Comprehensive mapping of mutations to the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human serum antibodies. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.12.31.425021.

24) Weisblum, Y. et al. Escape from neutralizing antibodies by SARS-CoV-2 spike protein variants. Elife 9, e61312 (2020).

25) Greaney, A. J. et al. Complete mapping of mutations to the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain that escape antibody recognition. Cell Host Microbe 29, 44–57 (2021).

26) Starr, T. N. et al. Prospective mapping of viral mutations that escape antibodies used to treat COVID-19. Science 371, 850–854 (2021).

27) Garcia-Beltran, W. F. et al. Multiple SARS-CoV-2 variants escape neutralization by vaccine-induced humoral immunity. Cell 184, 2372–2383.e9 (2021).

28) Walker, A. S. et al. Increased infections, but not viral burden, with a new SARS-CoV-2 variant. Preprint at medRxiv

https://doi.org/10.1101/2021.01.13.21249721.

29) Levine-Tiefenbrun, M. et al. Initial report of decreased SARS-CoV-2 viral load after inoculation with the BNT162b2 vaccine. Nat. Med. 27, 790–792 (2021).

30) Petter, E. et al. Initial real world evidence for lower viral load of individuals who have been vaccinated by BNT162b2. Preprint at medRxiv

https://doi.org/10.1101/2021.02.08.21251329.

31) COVID-19 Dashboard (Israeli Ministry of Health);

https://datadashboard.health.gov.il/COVID-19/general.

(accessed 26 May 2021)

32) Itokawa, K. et al. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE 15, e0239403 (2020).

33) Zhang, X. et al. pTrimmer: an efficient tool to trim primers of multiplex deep sequencing data. BMC Bioinformatics 20, 236 (2019).

34) Gelbart, M. et al. Drivers of within-host genetic diversity in acute infections of viruses. PLoS Pathog. 16, e1009029 (2020).

35) Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997).

36) Rambaut, A. et al. A dynamic nomenclature proposal for SARS-CoV-2 lineages to assist genomic epidemiology. Nat. Microbiol. 5, 1403–1407 (2020).

37) Dudas, G. et al. Travel-driven emergence and spread of SARS-CoV-2 lineage B.1.620 with multiple VOC-like mutations and deletions in Europe. Preprint at medRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.04.21256637. (2021).

38) McKinney, W. Data structures for statistical computing in Python. In Proc. 9th Python in Science Conference (2010).

39) Hunter, J. D. Matplotlib: a 2D graphics environment. Comput. Sci. Eng. 9, 90–95 (2007).

40) Villanueva, R. A. M. & Chen, Z. J. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis (Taylor & Francis, 2019).

41) Katoh, K. et al. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res. 30, 3059–3066 (2002).

42) Guindon, S. et al. in Bioinformatics for DNA Sequence Analysis (ed Posada, D.) 113–137 (Springer, 2009).