COVID-19関連追加(2021812-2

Nタンパク質によるNLRP3インフラマソームの活性化

SARS-CoV-2Nタンパク質は,NLRP3インフラマソームの活性化を促進し,炎症を引き起こす】

Pan, P., Shen, M., Yu, Z. et al. SARS-CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce hyperinflammation. Nat Commun 12, 4664 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25015-6.

Abstract

SARS-CoV-2感染時に誘発される過剰な炎症反応は,COVID-19の重篤な症状と関連している.また,SARS-CoV-2感染に伴って活性化されるインフラマソームも,COVID-19の重症度と関連している.今回我々は,SARS-CoV-2Nタンパク質NLRP3インフラマソームの活性化を促進し,炎症を誘発するメカニズムを明らかにしたNタンパク質は,炎症惹起性サイトカイン(proinflammatory cytokines)の成熟を促進し,培養細胞やマウスにおいて炎症性反応を誘導する.メカニズム的には,Nタンパク質はNLRP3タンパク質と直接相互作用し,NLRP3ASCの結合を促進し,NLRP3インフラマソームの形成を促進するさらに,Nタンパク質は,敗血症や急性炎症モデルマウスの肺傷害を悪化させ,死亡を促進し,IL-1βやIL-6活性化を促進することが明らかになった.さらに,NLRP3の特異的阻害剤であるMCC950やカスパーゼ1の阻害剤であるAc-YVAD-cmkによって,Nタンパク質による肺傷害やサイトカイン産生が阻害されることも明らかになった.本研究により,SARS-CoV-2Nタンパク質がNLRP3インフラマソームの活性化を促進し,過剰な炎症反応を誘導するという,他とは異なるメカニズムが明らかになった.

 

 

Figure 10: Model by which N protein induces lung injury by activating NLRP3 inflammasome.

SARS-CoV-2に感染すると,ヌクレオカプシドタンパク質(N)がNLRP3と直接相互作用し,NLRP3インフラマソームの形成と活性化を促進することで,多数の炎症性因子(IL-1β,IL-6TNFCCL2CCL8など)が産生され,マウスにおいて肺傷害が発生する.

Fig. 10

 

Discussion

SARS-CoV-2感染は急性肺傷害を引き起こすが,その原因の一つとして,肺の免疫システム制御異常7)8)が挙げられ,その結果、多数の炎症性因子が放出され,”サイトカインストーム”9)を形成する. 今回我々は,GEO databaseGSE155106)を解析し,SARS-CoV-2がマクロファージやDCsに感染すると,豊富なサイトカインやケモカインの発現が促進されることを発見した(we found that SARS-CoV-2 infection of macrophages and DCs would promote the expression of abundant cytokines and chemokines).次に,スクリーニングにより,SARS-CoV-2Nタンパク質がNLRP3インフラマソームを活性化することで炎症性因子の発現を促進し,その結果,マウス肺傷害や敗血症モデルのマウスの死を促進させることを発見した.さらに,Nタンパク質がNLRP3と直接相互作用することで,NLRP3インフラマソームの形成が促進され,それによってNLRP3インフラマソームが活性化されることが明らかになった.以上の結果から,SARS-CoV-2Nタンパク質がNLRP3インフラマソームを介して肺傷害を引き起こすという新しいメカニズムが明らかになった.

自然免疫システムの重要な一部であるNLRP3インフラマソームは,細胞傷害や病原性微生物感染を認識する上で重要な役割を果たしている10)11)12)13).我々のこれまでの研究では,デングウイルスのMタンパク質が,NLRP3インフラマソームを活性化することで,マウスの組織傷害や血管漏出を引き起こすこと14),ジカウイルスのNS5タンパク質が,NLRP3インフラマソームを活性化することで,ウイルスの脳への侵入を促進し,マウスの死を促進させること30)が明らかになっている.COVID-19では,NLRP3インフラマソームが重要な役割を果たしているのだろうか?今回の研究では,我々はSARS-CoV-2Nタンパク質が,炎症性因子の発現を促進することを発見した.しかし,NLRP3の特異的阻害剤であるMCC950やカスパーゼ-1の阻害剤であるAc-YVAD-cmk31)を添加すると,Nタンパク質によって誘導された炎症性因子レベルが回復した.Nタンパク質は,SARS-CoV-2の主要な構造タンパク質として,ウイルスの複製,構築,および免疫制御に関与している32)33).最も安定して発現している構造タンパク質であることから,SARS-CoV-2核酸検査におけるゴールドスタンダードとなっている.最近の研究では,Nタンパク質が二本鎖RNA結合活性を介して宿主のRNA干渉媒介性抗ウイルス反応(host RNA interference-mediated antiviral response)に対抗すること34)や,Nタンパク質が感染後に液性および細胞性免疫応答を誘導すること35)も明らかになっている.我々の結果から,SARS-CoV-2Nタンパク質は,ウイルスのエンベロープタンパク質の一部として,ウイルスの構築(viral assembly)に先立ってNLRP3の活性化を引き起こすために細胞質に存在し,急性炎症反応を活性化する危険性が高まることが明らかになった.

自然免疫システムの重要な炎症因子であるIL-1βとIL-6は、ウイルスに対する宿主の防御に重要な役割を果たしている36).我々の以前の研究では,デングウイルスがIL-1βの産生を誘導することにより,マウスの血管漏出を促進することが示されている37).さらに,IL-1βは非常に強力な炎症性メディエーターであり,血管拡張を誘導し,顆粒球を炎症組織に引き寄せる38)IL-1βの機能と同様に,IL-6もまた,追加の免疫メディエーターをリクルートすることで自然免疫応答を増幅させる役割を果たしている39).臨床研究では,SARS-CoV-2に感染した患者では、血清および肺胞洗浄液中のIL-1βおよびIL-6の発現が有意に増加していることがわかっている5).我々の結果はまた,血清および肺中のIL-1βおよびIL-6レベルは,Nタンパク質の肺特異的発現(lung-specific expression)によって増加するが,IL-1βおよびIL-6発現は,MCC950Ac-YVAD-cmkの投与によって,またはAAV-N感染NLRP3-/-マウスにおいて有意に減少することを示している.さらに興味深いことに,敗血症マウスモデルでは,Nタンパク質がマウスの死亡時間を有意に増加させるのに対し,MCC950Ac-YVAD-cmkの添加は死亡時間を遅らせるだけでなく,マウスの生存率を向上させた.このことから,SARS-CoV-2Nタンパク質は,IL-1βやIL-6などの炎症性因子の産生を誘導することで肺傷害を引き起こす可能性が示唆された.

NLRP3インフラマソームは,センサータンパク質(NLRP3),アダプタータンパク質(ASC),エフェクタータンパク質(カスパーゼ-1)から構成されている15)NLRP3インフラマソームが活性化されると,まずNLRP3の脱ユビキチン化41)と自己凝集(self-aggregation27)が起こり,続いてASCのリクルートとオリゴマー化28)が起こり,さらにプロカスパーゼ-1が活性型カスパーゼ-1p20)に切断され,それが成熟IL-1β(p17)およびIL-18を産生するためにpro-IL-1βとpro-IL-18を切断する16).この結果から,SARS-CoV-2Nタンパク質は,NLRP3と直接相互作用して,NLRP3タンパク質の凝集を促進することがわかり,さらにNタンパク質は,NLRP3ASCの相互作用を促進し,ASCのオリゴマー化を促進することがわかった.免疫蛍光実験では,N-NLRP3-ASCが複合体を形成し,NLRP3インフラマソームの活性化につながることが証明された.さらに興味深いことに,Co-IP実験により,Nタンパク質のCTDドメイン(260aa-340aa33)NLRP3との相互作用を媒介していることがわかったさらに,このドメインを欠くと,p17p20ASCのオリゴマー化レベルが著しく低下することがわかった.このことは,NNLRP3タンパク質との間の相互作用が,NLRP3インフラマソームの活性化に不可欠であることを示している.なお、今回の結果では,Nタンパク質が,同じくNLRP3インフラマソームの下流に位置するエフェクタータンパク質であるIL-18の発現に影響を及ぼさないことが示されており15),少し矛盾しているように感じられた.おそらく,Nタンパク質がIL-18mRNAレベルに影響を与えず,タンパク質の発現レベルが極めて低くなったため,Nタンパク質のIL-18に対する影響が検出されなかったのではないかと推測している.

Conclusions

本研究では,SARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質(NNLRP3と直接相互作用し,NLRP3インフラマソームの形成と活性化を促進することで,多数の炎症性因子が産生され,マウスの肺傷害が生じることを明らかにした.今回のデータは,NLRP3インフラマソームを阻害することで,SARS-CoV-2感染による”サイトカインストーム”と肺傷害を軽減できることを示しており,NLRP3インフラマソームがCOVID-19治療の潜在的な標的であることを示唆している

References

省略.

 

Resultsから一部抜粋:

GEOGene Expression Omnibus)データベースのデータセットGSE155106に基づいて,模擬感染した(mock-infected)マクロファージとSARS-CoV-2に感染したマクロファージおよび樹状細胞(DCs)におけるサイトカインおよびケモカインの発現状況を解析・比較した.その結果,SARS-CoV-2に感染したマクロファージ(Figure 1a)と樹状細胞(Figure 1b)では,炎症性サイトカイン(IL-1β,IL-6TNFIL-11IL-10IL-27)とケモカイン(C-X-Cモチーフケモカインリガンド8CXCL8),C-Cモチーフケモカインリガンド2CCL2),CXCL10IL-7)の発現が有意に誘導されることがわかった.〜

 

Figure 1: Transcriptional level of indicated gene in macrophage (a) and dendritic cells (b) infected with SARS-CoV-2 (GSE155106, RNA-Seq data from GEO database) were analyzed and the values were showed in logarithmic form. c HEK293T cells were transfected with plasmids encoding N, M, E, 3a, 6, 7a, 8, and 10 proteins for 24h. The indicated proteins in cell extract were analyzed by WB. d HEK293T cells were co-transfected with plasmids encoding NLRP3, ASC, pro-Caspase-1, or pro-IL-1β, and transfected with plasmids encoding N, M, E, 3a, 6, 7a, 8, and 10 for 48h. Supernatants were analyzed by ELISA for IL-1β. e PMA-differentiated THP-1 macrophages were transfected with plasmids encoding N, M, E, 3a, 6, 7a, 8, and 10 proteins for 48h, and then stimulated with 2μM Nigericin or DMSO for 2h. IL-1β in cell supernatants was measured by ELISA. f, g THP-1 cells were stably infected with Lentivirus-CT or Lentivirus-N, differentiated into macrophages. Lentivirus-N macrophages were then treated with MCC950 (0.01μM) for 1h. Cell lysates were analyzed by immunoblotting (f). The indicated gene mRNA was quantified by qRT-PCR (g). h, i C57BL/6 genetic background mice were tail vein-injected with 300μl containing 5×1011vg of AAV-Lung-EGFP (n=8) or AAV-Lung-N (n=16); after 2 weeks, they were treated with MCC950 (50mg/kg) or Ac-YVAD-cmk (8mg/kg) by intraperitoneal injection for AAV-Lung-N (n=8) mice; after 3 weeks, two mice for each group were killed and the lungs were collected. The indicated proteins were analyzed by WB (h). The indicated gene mRNAs were quantified by qRT-PCR (i). Mock means healthy donors (a, b), untreated cells (e), and injection of the same dose of PBS (i). Control means transfected with empty plasmids (c, d). Lipo means transfection with reagents Lipo2000 (e). Data are representative of three independent experiments and one representative is shown. Error bars indicate SD of technical triplicates. Values are mean±SEM. *P0.05, **P0.01, ***P0.001, two-tailed Students t-test. Source data are provided as a Source Data file.

Fig. 1