COVID-19関連追加(2021819日)事前に活性化された自然免疫と小児の早期感染

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2021129日(重症COVID-19患者のIIFN活性傷害について)

【上気道において事前に活性化された抗ウイルス自然免疫が小児のSARS-CoV-2早期感染を制御する】

Loske, J., Röhmel, J., Lukassen, S. et al. Pre-activated antiviral innate immunity in the upper airways controls early SARS-CoV-2 infection in children. Nat Biotechnol (2021).

https://doi.org/10.1038/s41587-021-01037-9.

Abstract

小児は成人に比べてSARS-CoV-2の感染率が低下し,重症COVID-19の発症リスクが大幅に低下している.しかし,若年層における防御の分子メカニズムはまだ明らかではない.本研究では,4週〜77歳までの年齢を網羅し,SARS-CoV-2陰性の小児(n= 18)と年齢を一致させたSARS-CoV-2陽性の小児(n= 24),そして成人(n=44)の上気道におけるシングルセルトランスクリプトームランドスケープ(single-cell transcriptional landscape)を特徴付けた.小児は,上気道上皮細胞,マクロファージ,樹状細胞において,MDA5IFIH1)やRIG-IDDX58)などのパターン認識受容体の基礎発現が高く,その結果,SARS-CoV-2感染に対して,成人よりも強い自然抗ウイルス応答が見られた.さらに,KLRC1NKG2A+細胞傷害性T細胞およびメモリーフェノタイプ(memory phenotype)のCD8+T細胞集団など,異なる免疫細胞集団が小児に主に見られた.今回の研究により,小児の気道免疫細胞は,ウイルスを感知するための準備が整っており,その結果,SARS-CoV-2感染に対する初期の自然免疫応答が成人よりも強いことが示された.

Main

COVID-19の感染リスクが同程度であるにもかかわらず,若年になるほど発症リスクが大幅に低くなることが繰り返し報告されており,年齢が上がるにつれて死亡率が劇的に上昇することにも反映されている1)2)3).これらの観察結果は,小児の方がSARS-CoV-2感染を制御する能力が高い可能性を示唆している.SARS-CoV-2の感染制御を成功させるには,パターン認識受容体(PRRs: pattern recognition receptors)とI型およびIII型インターフェロン(IFN)システムを介した,早期の細胞内在性自然免疫応答(early cell-intrinsic innate immune response)が重要であることが示されている4).これらの観察と並んで,最近の研究では,重症COVID-19あるいは救急外来を受診した成人/小児を比較し,小児のCOVID-19ではIFN応答が低下していることが報告されている(refs. 5, 6).しかし,特に症状がない,あるいは軽度/中等度の症状しかない若年層におけるCOVID-19に対する防御の分子メカニズムはまだわかっていない.

SARS-CoV-2感染を早期に制御する小児のより高い能力を理解するために,我々は,SARS-CoV-2陰性およびSARS-CoV-2陽性の小児および成人において,SARS-CoV-2感染の感受性が高い気道領域7)である上気道のトランスクリプトームランドスケープ(transcriptional landscape)を系統的に特徴付けた.

 

Results

Different cellular composition in the upper airways of children and adults:

我々は,3つの異なるCOVID-19コホートの研究参加者を対象とした: すなわち,小児とその家族のCOVID-19に関するRECAST研究,Pa-COVID-19研究,SC2研究8)9)であり,SARS-CoV-2陰性およびSARS-CoV-2陽性の小児(n= 42)と成人(n= 44)を対象とした.得られたデータセットは,合計268,745個の細胞で構成されている(Figure 1a).SARS-CoV-2PCR結果が陽性であった生後4週間から77歳までの人と,年齢を一致させたSARS-CoV-2陰性の対照群から,上気道(鼻)サンプルを採取した(Supplementary Tables 1 and 2).今回の研究では,感染初期に焦点を当て,軽症/中等症COVID-19症例のみを対象とした(Figure 1a.シングルセルRNAシーケンスsingle-cell RNA sequencing scRNA-seq)に基づき,我々は上気道には,21種類の免疫細胞および12種類の上皮細胞サブタイプを含む,33種類の異なる細胞を同定した(Figure 1b, Extended Data Figure 1a, b).鼻粘膜における免疫細胞および上皮細胞のコンパートメント構成については,小児と成人の間で顕著な違いが見られた.健常成人の鼻腔サンプルでは,免疫細胞はほとんど検出されなかったが,SARS-CoV-2陰性の小児のサンプルでは,ほぼすべての免疫細胞サブセットが多量に含まれており,全体的に好中球が優勢であった(Figure 1b, c, Extended Data Figure 2a成人では,SARS-CoV-2感染と免疫細胞の流入は関連があるが,一方小児では免疫細胞と上皮細胞の割合はほぼ一定であった(Figure 1c, Extended Data Figure 2a感染すると,小児の好中球は成人の感染者よりも顕著に活性化されたフェノタイプを示し,例えばCCL3CXCR1/2の発現が亢進することが特徴的であった(Supplementary Table 4

Figure 1: Age-dependent changes in cell composition of the upper airways.

a, Nasal samples of children (n=42) and adults (n=44) were collected from individuals negative and positive (asymptomatic/mild/moderate COVID-19) for SARS-CoV-2 and subjected to scRNA-seq. b, Uniform manifold approximation and projection (UMAP) showing all identified individual immune and epithelial cell types and states. MC/basophil, mast cells or basophils; moMa, monocyte-derived macrophages; nrMa, non-resident macrophages; rMa, resident macrophages; mDC, myeloid dendritic cells; CD11c_mDC, CD11c-expressing mDC; pDCs, plasmacytoid dendritic cells; DNT, double-negative T cells; NK, natural killer cells; NKT, natural killer T cells; p_NKT, proliferating NKT cells; ag_T, aging T cells; CD8_Tm, memory CD8+ T cells; CTL1 and CTL2, type 1 and 2 cytotoxic T cells; IL-17A_CD8, IL-17A-expressing CD8 T cells; IL-17a_CD4, IL-17A expressing CD4+ T cells; p_T, proliferating T cells; Cil-diff, differentiating ciliated cells; Epi_low RNA, epithelial cells with low RNA; FOXN4, FOXN4+ cells. c, Scaled UMAPs displaying 45,000 cells per group reveal pronounced differences in the nasal cell composition of SARS-CoV-2-negative and -positive children and adults. d, Table showing all cell types/states significantly different between children and adults in non-infected individuals. Given are mean differences in percent; positive values indicate a higher number of cells of the respective cell population in children compared to adults. Comparisons were performed by Kruskal–Wallis test followed by Dunn’s two-sided post hoc comparison with Benjamini–Hochberg correction (***P<0.001; Neutrophil, 5.54×107; CD8_Tm, 1.97×104; CTL2, 1.83×105; Basal, 6.96×105; Ciliated, 9.18×107; also see Extended Data Fig. 2a). e, Scatter plots representing changes of specific immune and epithelial cells over time. Depicted are the percentages of the respective cell type/state with respect to all cells for immune cells (left) or epithelial cells (right) of each individual. Individuals negative for SARS-CoV-2 are indicated in gray, individuals positive for SARS-CoV-2 in red. Lines represent curve fitting results by local polynomial regression (LOESS). The P values are from linear regression analysis (Benjamini–Hochberg adjusted two-tailed).

 

 

Fig. 1

興味深いことに,多くの上皮細胞集団は明らかな年齢依存性を示し,例えば,杯細胞は年齢とともに減少し,線毛細胞は増加した(Figure 1d, e.最近の補完的な研究では,bulk RNA-seq and cell deconvolution methodsに基づいて,健常小児とSARS-CoV-2感染小児の鼻粘膜の細胞構成を分析した.著者らは,小児特異的杯細胞を同定することはできなかったが,健常小児のサンプルでは線毛細胞の特徴が見られたと報告され,bulk RNA approachesの限界が強調された10)

SARS-CoV-2 entry receptors are not differentially expressed in children compared to adults:

SARS-CoV-2の侵入受容体をエンコードするACE2と,侵入関連プロテアーゼをエンコードするTMPRSS2FURINCTSBCTSLCTSVの発現レベルは小児と成人でほぼ同じであり,軽症/中等症COVID-19では未感染時に比べて上昇しなかった(Extended Data Figure 2b.したがって,これらのウイルス侵入因子は,小児と成人の間のSARS-CoV-2の病態の違いを説明できない.

Children show enhanced viral sensing in airway epithelial cells:

SARS-CoV-2は,非常に高い複製速度を持つプラス鎖RNAウイルスである11)12).したがって,SARS-CoV-2の感染を制御するためには,最適な初期の協調した自然抗ウイルス免疫が必要である.この応答は,さまざまなPRRsによって活性化される.最近では,上皮細胞におけるSARS-CoV-2の主要なPRRMDA5IFIH1であり,RIG-IDDX58はマイナーだが付加的な役割を果たしている可能性があることを裏付ける証拠が次々と示されている13)14)(筆者未発表データ)MDA5によるウイルスRNA感知の重要なエンハンサーはLGP2(DHX58)である15)重要なことに,PRRs,特にMDA5およびLGP2は,多くの種類の上皮細胞における発現は弱いが,細胞のウイルス感染時や,I型またはIIIIFNに対する分泌曝露時には,ポジティブフィードバック制御によって大きく発現がアップレギュレーションされる.このフィードバック制御の動態は,感染したウイルスの制御を成功させるために非常に重要である(Figure 2a).最近の臨床研究において,PRR/IFNシステムのさまざまな遺伝子座における先天的なエラーと重症COVID-19リスクの増加との間の強い関連性が報告されていることから(ref. 16)SARS-CoV-2感染を解決させるためのPRR/IFN軸の重要性が示されている.同様に,重症COVID-19患者では,より広い範囲の患者に影響を及ぼす,IIFNに対する自己抗体が非常に高い頻度で出現することが示されている(ref. 17)

Figure 2: Enhanced viral sensing in children’s epithelial cells.

a, Schematic representation of epithelial response to SARS-CoV-2 infection including genes involved in virus sensing and subsequent IFN response; created with BioRender.com. b, Dot plots depicting the expression of virus-sensing genes in epithelial cells of children and adults. Each significant increase comparing SARS-CoV-2-negative children (n=18) with SARS-CoV-2-negative adults (n=23), and SARS-CoV-2-positive children during the early (days post-onset of symptoms (dps)4, n=11) or late infection phase (dps 512, n=11) with SARS-CoV-2-positive adults amid the early (n=13) or late (n=8) infection phase, respectively, is marked by a red circle (BenjaminiHochberg-adjusted two-tailed, Wilcoxon P<0.05). Ave. exp., average gene expression; Pct. exp., percentage of cells expressing the gene. c, Violin plots showing expression of prototypical virus-sensing genes in epithelial cells of SARS-CoV-2-positive patients (n=45) in relation to days after first symptoms. d, Heat map showing scaled expression of 171 representative ISGs in all epithelial cells during the early SARS-CoV-2 infection phase (dps4). Only selected genes are annotated; for a completely annotated heat map, see Extended Data Fig. 3. e, Differential expression of selected ISGs in an in vitro model comparing the response to SARS-CoV-2 infection in MDA5 (encoded by IFIH1)-overexpressing A549ACE2 cells and empty vector controls. n=3 biologically independent replicates; error bars show mean±s.e.m.; *P<0.05, ***P<0.001 (IFNB1, 5.47×104; MX1, 2.63×102; BST2, 8.74×104; RSAD2, 4.24×102; IFIT1, 1.30×102) from one-tailed Student t-test.

Fig. 2

特に,健常小児の上気道の上皮細胞では,RIG-IMDA5LGP2をコードする遺伝子の基礎発現レベルが,成人に比べて有意に高いことがわかった(Figure 2bこの結果は,小児の呼吸器粘膜ではウイルス感染に対する反応性が高まっていることを示唆しており,さらに,小児の上気道では自然免疫細胞の量が非常に多くなっていることからも裏付けられる(Figure 1, Extended Data Figure 2aSARS-CoV-2陽性の小児および成人の上皮細胞では,特にCOVID-19症状の発症時にこれらの遺伝子の発現レベルが高いことが観察されFigure 2c4日目までは低下する傾向にあり(04日目,初期段階early phaseと呼ぶ),その後の病期(症状発症後512日目,後期段階late phaseと呼ぶ)ではより低いレベルにとどまった.これらのPRRsの基礎発現がより高ければ,感染した上皮細胞のMDA5/LGP2SARS-CoV-2を直ちに感知することができると推測できる(Figure 2a).驚くべきことに,小児の気道上皮細胞は,SARS-CoV-2陽性の成人の上皮細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルと比較して,特に発症後の疾患初期に,これらのPRR遺伝子の発現が増加していたFigure 2b5日目以降は,小児と成人の間でウイルス感知はほぼ同等であるFigure 2b, 下段のプロット)

ウイルス感知後,IRF3/NFκBを介したシグナル伝達により,一次抗ウイルスエフェクター(primary antiviral effectors),さらにIFNβやIFNλなどの抗ウイルスサイトカインが発現する(Figure 2aIFNはオートクライン(分泌された物質が分泌した細胞そのものに作用する)およびパラクライン的に上皮細胞に作用し,組織内のMDA5/LGP2の反応性をさらに高め,広範囲のIFN刺激遺伝子(ISGs: IFN-stimulated genes)を誘導するI型およびIIIIFNの発現そのものを検出することはできなかったが,ISGsSARS-CoV-2陽性小児の上皮細胞において印象的な活性化パターンを示し,その中にはLY6E(ref. 18)IFITM2BST2(ref. 19)など,これまでにSARS-CoV-2に対して強い抗ウイルス活性を示すことが示された多くの遺伝子が含まれていた.すべての上皮細胞,特に線毛細胞において,ISG発現の大きさは,感染初期と感染後期のいずれにおいても,感染した成人のそれをかなり上回り(Figure 2d, Extended Data Figure 3),後期には全般的に減少する傾向が見られた(Extended Data Figure 3

SARS-CoV-2感染時のMDA5発現レベルとISGs活性化との直接的な関連性を示すために,我々はヒト肺上皮細胞ラインA549を用いたin vitroモデルを構築した.A549は,健常成人の鼻上皮細胞で見られる発現レベルと同様に,MDA5の基礎発現レベルが非常に低い.予想通り,この細胞では,急速な複製とウイルスにエンコードされたアンタゴニスト(virus-encoded antagonists)の発現20)に伴い,非効率なMDA5感知に基づいて,SARS-CoV-2感染時に誘導されるIFNB1およびISGの転写産物(transcripts)はわずかであった.しかし,レンチウイルスを導入して(lentiviral transductionMDA5の基礎発現を適度に(moderately)増加させ,アンタゴニストの発現前にウイルスを効率的に感知できるようにした細胞では,IFNB1MX1BST2tetherin),RSAD2viperin),IFIT1などの主要なISGsの発現が有意に誘導されることが確認された(Figure 2e).これらの結果は,感染前のMDA5の発現が,SARS-CoV-2を感知し,迅速かつ強固なISGs応答を誘導する上で,中心的な役割を果たしていることを裏付けている

 

 

Enhanced innate immune cell activation in children:

免疫−上皮細胞間の相互作用を調べると,特に感染前には,成人と比較して小児の方が,免疫−上皮細胞間のクロストーク(cross talk. シグナル伝達経路が情報を伝えるときに他の伝達経路と影響しあう)が強いことがわかった.免疫細胞の中では,非常在マクロファージ(nrMa: non-resident macrophages),単球由来マクロファージ(moMa: monocyte-derived macrophages),およびCD11c+樹状細胞(CD11c_mDC: CD11c+ dendritic cells)が最も相互作用が強かった(Figure 3aこれらの免疫細胞サブセットは,IL1BIL8TNFCCL3CCL4などのサイトカインやケモカインをコードする遺伝子の発現量が増加していることからもわかるように,小児ではより高い活性化状態にあることがわかった(Figure 3bさらに,SARS-CoV-2感染小児のmoManrMaCD11c_mDCでは,感染初期にIFIH1発現レベルが増強され,moMaおよびnrMaではTLR2が有意に増加していることが確認されたこのことは,これらの細胞がウイルス感知とIFN産生に付加的な役割を果たしている可能性を示唆している.このことは,SARS-CoV-2陰性小児のmoManrMaおよびCD11c_mDCが,成人よりも高いレベルでIFIH1およびTLR2を発現していることからも明らかである.

Figure 3: Differential immune response in children and adults.

a, Heat maps depicting cell–cell communications between all identified cell types derived from linear-scaled ligand–receptor interaction counts in children (left, n=18 SARS-CoV-2 negative, n=11 SARS-CoV-2 positive early infection phase (dps4), n=11 SARS-CoV-2 positive late infection phase (dps 512)) and adults (right, n=23 SARS-CoV-2 negative, n=13 SARS-CoV-2 positive early infection phase, n=8 SARS-CoV-2 positive late infection phase). b, Dot plots depicting expression of genes involved in antiviral and cytotoxic response of myeloid dendritic cells and different macrophage populations. Each significant increase comparing SARS-CoV-2-negative children (n=18) with SARS-CoV-2-negative adults (n=23) and SARS-CoV-2-positive children during the early (n=11) or late (n=11) infection phase with SARS-CoV-2-positive adults amid early (n=13), or late (n=8) infection phase, respectively, is marked by a red circle (BenjaminiHochberg-adjusted two-tailed Wilcoxon, P<0.05). Ave. exp., average gene expression; Pct. exp., percentage of cells expressing the gene. c, UMAP displaying the different T/NK cell subpopulations in the nose of children and adults. In comparison, scaled density plots are shown indicating the proportion of the different T/NK cells in children and adults separated by their SARS-CoV-2 infection status. Yellow represents high density; blue represents low density. d, Violin plots showing expression of representative immune mediators of the CTL2 subpopulation comparing SARS-CoV-2-negative children (n=18) with SARS-CoV-2-negative adults (n=23) and SARS-CoV-2-positive children during the early (n=11) or late (n=11) infection phase with SARS-CoV-2-positive adults amid the early (n=13) or late (n=8) infection phase, respectively. Each dot represents one cell. Plots show median, ***P<0.001 (IFNG negative: 1.50×1017, IFNG early phase: 1.14×1047, IFNG late phase: 1.69×1027, CCL5 negative: 5.97×1030, CCL5 late phase: 6.32×1073), derived from two-tailed Wilcoxon comparison.

Fig. 3

Distinct immune cell subpopulations in children:

気道上皮細胞,マクロファージ,樹状細胞などの細胞内抗ウイルス能力(cell-intrinsic antiviral capacity)がアップレギュレーションされていることは別として,小児と成人では免疫細胞の亜集団のパターンが異なることがわかった.我々は特に,KLRC1NKG2A+細胞傷害性T細胞(CTL2)の亜集団が,小児では優勢であることを同定した(Figure 3c).NKG2Aは,細胞傷害性T細胞上のレクチン様抑制受容体(lectin-like inhibitory receptor)であり,過剰な活性化を抑制し,アポトーシスを防ぎ,ウイルス特異的CD8+T細胞応答を持続させる役割を担っている21).このCD8細胞傷害性T細胞サブセットは,ウイルス感染のない状態でも,細胞傷害性メディエーターの強い発現レベルによって特徴付けられた(Figure 3d, Extended Data Figure 4, Supplementary Table 5).さらに,SARS-CoV-2陰性の小児と成人を比較すると,これらの細胞ではIFNGが高発現していた.感染時では,小児は成人に比べて,感染初期と感染後期の両方で,IFNG発現が有意に高いという特徴があった.同様に,強力なchemoattractant geneであるCCL5の発現も,感染の有無にかかわらず、成人に比べて小児で増加していた(Figure 3d).ウイルスに感染した細胞を効率的に殺すために必要な細胞障害性の可能性と,この細胞障害性T細胞サブセットの優位性は,成人に比べて小児の方が,抗ウイルス応答が優れていることのさらなる証拠となる.さらに,SARS-CoV-2に感染した小児では,成人にはほとんど見られないメモリーフェノタイプのCD8+T細胞集団(CD8_Tm)が見られた(Figure 3c, EDF4.これらの細胞が,将来の再感染に対する小児の保護に有益であるかどうかは,まだ明らかではない.

 

コホート:

この3つのコホートから,COVID-19重症度のWHOガイドライン29)に基づいて無症候性,軽症,中等症に分類された患者が登録された.SARS-CoV-2陽性と確認された45人の患者の鼻腔ぬぐい液を分析したところ,生後4週間〜17歳までの小児24人(年齢中央値9.0±5.6, 女性10, 男性14人)と,21歳から76歳までの成人21人(年齢中央値39.0±10.4, 女性12, 男性9人)から構成されていた.いずれの小児も入院はしていないが,全員が家庭内隔離された.さらに,416歳の小児18人(年齢中央値9.0±3.8, 女性8, 男性10人)と2477歳の成人23人(年齢中央値46.0±16.3, 女性13, 男性10人)(Supplementary Tables 3 and 4)の健康なSARS-CoV-2陰性対照者42人の鼻腔ぬぐい液も含まれている.すべての陰性コントロールは,詳細な問診によってSARS-CoV-2に曝露した可能性が調査された.SARS-CoV-2に曝露したことが判明した場合は,サンプリング時と14日後に追加の血清学的検査を実施するか,参加者およびその家族に少なくとも2週間連続して感染の兆候がなく,定期的な検査で陰性結果が得られていることを確認するために追跡調査を行った.

 

Discussion

我々のデータは,小児の上気道(鼻)の上皮細胞および免疫細胞が,ウイルスを感知するため,事前に活性化され,そして準備されている(primedという明確な証拠を示している.これは,小児の粘膜免疫応答の一般的な特徴であると考えられるが,SARS-CoV-2には特に関連性がある.ごく最近では,チクングニアウイルスに感染した線維芽細胞のscRNA-seqから,ウイルスタンパク質の産生によって抗ウイルスシステムが遮断される前に,細胞がIFNを発現する機会が極めて狭い(narrow window of opportunityことが示された22).このことは,SARS-CoV-2とその他の呼吸器ウイルス(RSウイルス,A型インフルエンザウイルス,SARS-CoVなど)との誘導された宿主応答の違いを説明している可能性がある.SARS-CoV-2の特徴は,細胞内での複製が広範囲に及び(extensive intracellular replication),IFNの産生/分泌の顕著な欠如(remarkable absence of IFN production and secretion)である一方で,SARS-CoV-2は,肺上皮細胞で示されているように,感染前または感染後のIFNによる処理に非常に敏感である(SARS-CoVよりもさらに敏感である)20)23).小児の場合,ウイルスを感知し,自然免疫応答が事前に活性化されているため,感染した気道でIFNが早期に効率的に産生され,IFN-(前)処理した細胞においてin vitroで観察されたものと同様の実質的な抗ウイルス効果を媒介すると考えられる.最終的には,小児の場合,ウイルス複製が減少し,クリアランスが早くなる可能性がある.実際,いくつかの研究では,成人に比べて小児の方がSARS-CoV-2の排除が早いことが示されており,これは小児の方がウイルスの複製を早期に停止させるという概念と一致している24)25)26)27)RSウイルスやA型インフルエンザウイルスなど,より効率的にIFN応答を誘導する他の呼吸器ウイルスの場合,事前に活性化された自然免疫応答はあまり関係ないかもしれない.小児では,SARS-CoV-2IFN感受性が高いことに加えて,増強された自然免疫があるために,成人に比べて小児が早期の感染を制御しやすく,その結果,COVID-19重症化リスクが低いと考えられる

 

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