COVID-19関連追加(2021820日)

患者から発生したSARS-CoV-2エアロゾルサイズと培養可能性

当院HP関連追加(2020725-2)(この論文のプレプリント[Posted July 21, 2020]

【患者から発生したSARS-CoV-2エアロゾルサイズと培養可能性】

Santarpia, J.L., Herrera, V.L., Rivera, D.N. et al. The size and culturability of patient-generated SARS-CoV-2 aerosol. J Expo Sci Environ Epidemiol (2021).

https://doi.org/10.1038/s41370-021-00376-8.

Background

COVID-19のエアロゾルによる伝播(aerosol transmission)は,現在も政策論争の対象となっている.COVID-19感染者から発生するエアロゾルの特徴を把握することは,感染におけるエアロゾルの役割を理解する上で非常に重要である.

Objective

20204月に混合急性期病棟に入院したCOVID-19患者6人から採取されたサイズ分画したエアロゾル中のウイルスの存在を調査した.

Methods

COVID-19陽性患者から,サイズ分画したエアロゾルサンプルとエアロゾルサイズ分布を採取した.エアロゾルサンプルのウイルスRNAを分析し,陽性サンプルはVero E6細胞で培養した.細胞のserial RT-PCRにより,ウイルス複製が起こっていると思われるサンプルが示された.ウイルスの存在はウエスタンブロットと透過型電子顕微鏡(TEM)でも調査された.

Sample collection:

エアロゾルサンプリングは,20204月の3日間,2つの病棟(5病棟と7病棟とする)の5つの部屋にいる6人の患者を中心に行われた(Table S1).7病棟は各部屋が廊下に対して陰圧で運用されていたが,5病棟の部屋は個別に隔離することができなかった.5病棟の場合は,病棟全体を残りのフロアと一緒に陰圧化された.7病棟では,換気,冷暖房が中央で管理されている.5病棟では,各部屋に中央の換気があり,冷暖房は各部屋に局所的なファンコイルユニット(fan coil unit)が設置されている.部屋の表面は毎日消毒された.Aerodynamic Particle Sizer Spectrometer APS 3321; TSI, Inc., Shoreview, MN)を用いて,0.5µm20µmまでのエアロゾル濃度とサイズ分布を測定した.また,NIOSH BC251サンプラー[25, 26]を用いて,rRT-PCRおよび培養分析のためのサイズ別エアロゾルサンプルを採取した.BC251は乾燥空気サンプラーで,3.5Lpmで動作させると,15mLのコニカルチューブ(conical tube)に集められた> 4.1µmの粒子1.5mLのコニカルチューブに集められた14µmの粒子,そして< 1µmの粒子を集める37mmのフィルターの3ステージサイズに分けられたエアロゾルが得られる.これらの研究では,ウイルス完全性(viral integrity)を維持するために,最終ステージでゼラチンフィルター(Sartorius, GmbH)を使用した[27].これらの研究では,各部屋で30分間,1分間隔でAPSの測定を行ったが,5C室ではデータを収集するラップトップのバッテリーが切れたため,10分後にサンプリングが中止されたことを除いては,1分間隔で測定を行った.BC251サンプラー1台は,各部屋の患者のベッドの足元で,床から1.1mの高さに両インレットを設置し,APSと同時に30分間動作させた.コントロールとして37mmゼラチンフィルターを使用し,サンプルの取り扱いや処理中のクロスコンタミネーションを監視した.

Results

6つの部屋すべてにおいて,BC251サンプラーの3ステージすべてで,rRT-PCRによりウイルスRNAの存在が確認された(Fig.1; Table S4さらに,回収したサンプルをVero E6細胞に曝露したところ,18サンプルのうち3サンプル(7B5A5CFig.1)において,6日後(5A室のサブミクロンサンプルの場合は5日後)に統計的に有意なウイルス増殖が認められた(95% confidence based on P<0.051-4µmのサンプルのうち2つは,90-95% confidenceでウイルス増殖を示した7Bおよび5C; Fig.11つのサンプルでは,細胞培養中にウイルスRNAが決定的に失われ(5B > 4.1 µm; Fig.1),増殖率(growth ratio <1であることが示された.抽出したRNAの模擬感染(mock infection)は,細胞培養1日後にrRT-PCRで検出されなかったことから,培養したエアロゾルサンプルで観察された増幅は,free RNAからのものではない可能性が高いことが示された.既知のウイルスを播種した培養では,10-1 pfu/mLFig.1に示す)および100 pfu/mLTable S4に示す)で統計的に有意な複製を示し,最低濃度(10-2)では複製が見られなかった.

 

 

Fig.1: Measured Airborne RNA Concentrations and Associated Percent Change in Viral Copies in Cell Culture.

空気中のrRT-PCR RNAコピー/Lの測定値(黒)は,最初のウイルスRNA濃度を示し、変化したウイルスRNA(赤)は,細胞培養におけるウイルス複製(またはその欠如)を示す.エラーバーは,RT-PCRで得られた濃度の標準偏差(空気中の濃度について)と,計算された測定の不確かさ(細胞培養中の変化率(percent change)について)を示す.1日目の細胞培養上清中のRNAと最終日のRNAを比較したP値は,変化が正でP値が< 0.1の場合に示す.サブミクロンフィルターサンプル6つのうち3つは,Students T Testに基づいて,有意(P< 0.05)な細胞培養の増加を示した(7B5A5C1-4μmのサンプルのうち2つは,P値が< 0.1であったが,< 0.05ではなかった(7Aおよび5C))4.1μmを超えるサンプルでは,統計的に有意な再現性を示したものはなかった.比率が1未満のサンプルは,培養の最初の日と最後の日の間にRNAが失われたことを示している.細胞培養コントロール(右側)は,抽出したRNAと同様に,既知の濃度の実験培養ウイルス(known concentration of laboratory cultured virus)を導入した場合の結果を示している.

Fig. 1

 

 

その後、rRT-PCRによって> 90 confidenceで複製が確認された5つの環境サンプルからの細胞について,ウエスタンブロットによるウイルスタンパク質の産生を,そして透過型電子顕微鏡(TEM)でintact SARS-CoV-2ビリオンの存在を調べた.SARS-CoV-2の存在は,これらのサンプルのうち1つを除くすべてのサンプルでウエスタンブロットにより観察された(< 1μm, 7B; Fig.2.コントロールゲルの画像(Fig.S1)は、少なくとも10-1の力価で感染を開始した場合の,同様のタンパク質バンドを示している.5C室のサブミクロンサンプルでは,TEMによりintact ウイルスが観察されたが(Fig.3),これらのビリオンが細胞培養の間に産生されたものかどうかは決定できない

Fig. 2: Protein expression of SARS-CoV-2.

Cell protein lysates were prepared from the indicated cultured samples and subsequently probed by western blot with a mouse monoclonal anti-SARS nucleocapsid protein (SARS-CoV N) antibody and an anti-GAPDH loading control antibody. The gel images between 40 and 55kDa are shown. Images of control gels from infections initiated at titers from 102 to 102pfu/mL are shown in supplementary Fig. S1, for comparison.

Fig. 2

 

 

Fig. 3: Electron micrographs of SARS-CoV-2 virions cultivated from the sub-micron filter from Room 5C.

The same image is shown at two magnifications: (A) ×30,000 and (B) ×110,000. Identifiable SARS-CoV-2 virions can be seen at both magnifications, and are indicated by red arrows in (B).

Fig. 3

 

5病棟の部屋で測定されたエアロゾルのサイズ分布はすべて似ているが,7病棟の部屋は5病棟の部屋よりもはるかに低い濃度と幅広いサイズ分布を示している(Fig.S2).各病棟の部屋間での類似性と,2つの病棟間での違いは,患者が生成するエアロゾルの違いというよりも,むしろ背景のエアロゾルによるところが大きいと思われる.測定された分布は,対数正規分布を用いてパラメータ化され,BC251で測定されたRNA濃度と比較して,バックグラウンドから切り離された人為的に生成されたウイルスエアロゾルのモードを特定しようと試みた.測定されたAPSエアロゾルの質量分布から,2つの対数正規分布が算出された(Fig. S2, Table S5).小モード分布の平均直径は,サンプリングしたすべての部屋で0.64µm0.80µmの間であり(Table S5),分布の幅(GSD)は1.171.30の間で変動していた.大モード分布は,平均直径と幅の両方でより多くの変動があった(Table S5).残念ながら,APSの各モード(単独または複合)とBC251で採取したサイズ別エアロゾルから抽出したRNAとの間には,統計学的に妥当な関係は認められなかった(Table S6).したがって,患者から発生したエアロゾルは,測定されたサイズ分布の一部ではあるものの,これらの部屋のバックグラウンドエアロゾルと分けることができない.各部屋のバックグラウンドエアロゾルをより詳細に分析しなければ,サイズ分布だけではヒトが発生させたエアロゾルの一部を特定することはできないだろう.

 

 

Discussion

この研究では,患者間のエアロゾル伝播を引き起こす可能性のある粒子に含まれるSARS-CoV-2の存在を特徴づけることを目的とした.患者が発生させたエアロゾルは,サイズ分布だけではバックグラウンドと分離できないが,BC251ステージから抽出したSARS-CoV-2 RNAから,ヒトの呼吸活動がその粒子を発生させているという情報が得られる.BC251の最小ステージで採取されたエアロゾル(< 1µm)は,過去の研究で測定された呼気の最小モードで見つかった粒子と一致している[30,31,32,33].このモードのエアロゾルは,呼吸,発声,咳など,ヒトのあらゆる呼吸活動で観察され[25],気管支領域[33]bronchiolar fluid film burst mechanism[31]と呼ばれる)と喉頭[33]の両方で生成された粒子に起因するとされている.BC2511-4µmステージで採取されたエアロゾルのヒトに関連した分画も,発声や咳の際に多く生成される気管支領域と喉頭領域の両方で生成されたものと一致している[33]BC251の最大サイズビン(> 4.1µm)に採取されたエアロゾルは,ほぼパラメータ化された最大サイズモードの粒子のみで構成されており,APSで測定されていない他の粒子や飛沫も含まれている可能性が高い.このような大きな粒子のヒトから生成された分画は,主に口腔と喉頭から来ており,気管支からの寄与は限られているか全くないと考えられる[33].この最大ステージのエアロゾルには一貫してウイルスRNAが観察されたが,これらのサンプルにはウイルス複製の証拠は観察されなかった.この所見は,Lednickyによる他の最近の観察結果と一致している[15].これらの粒子の可能性のある発生源の違いは,呼吸器管のより深いところで発生した粒子が培養できる可能性が高いことを示しているのかもしれない.

感染性SARS-CoV-2粒子を含む微細モードのエアロゾル粒子を観察すると,SARS-CoV-2の可能性のある伝播についていくつかの一般的な見解が得られる.本研究の結果に加え,エアロゾル中でのSARS-CoV-2の安定性[16, 17]の証拠とともに,SARS-CoV-2が呼吸器組織に感染することを示す証拠[23]は,SARS-CoV-2が空気媒介性伝播する可能性を示唆している.さらに,微細モードのエアロゾルは,一般的に幅広い呼吸活動において気管支や喉頭で生成される.これは,咳などの症状がなくてもSARS-CoV-2エアロゾルが観察される先行研究[20]や,無症候性感染者による伝播の報告[21, 22]とも一致する.

SARS-CoV-2が複製されていることを示す最も確実な証拠は,BC251サンプラーの最終ステージで採取されたサブミクロンのエアロゾルから検出された.このサンプラーは,もともとエアロゾル中のSARS-CoV-2を採取して保存することを目的としたものではなく,この方法がウイルスの感染性を維持するのにどれほど効果的であるかを調べる研究はまだ行われていない.サンプラーの最初の2つのステージでは,ウイルスは慣性による衝突(inertial impaction)を利用して2つの乾燥した円錐形のチューブにサンプリングされる.この収集メカニズムが,14µmおよび> 4.1µmのステージで採取されたウイルスの完全性(integrity)を低下させている可能性がある.本研究では,採取時にintactウイルスを保存するために,BC251の最終ステージにゼラチンフィルターを採用したが,このステージでウイルス複製が観察されたことは注目に値する.しかし,Ratnesar-Shumate[34]によると,ゼラチンフィルターとPTFEフィルターの性能は,全体としてBC251と同様に類似しており,本研究で使用した採取メカニズムは,ウイルスの安定性に大きな影響を与えない可能性が示唆されている.これらの実験で生成されたエアロゾルは,人が生成した粒子とは組成や大きさが異なるため,これらの結果をヒトが生成したエアロゾルの採取に直接適用することには限界があるかもしれない.したがって,感染性SARS-CoV-2は,< 1μmの粒子に存在する,そして4μmまでの粒子にも存在する可能性があると言えるが,エアロゾル採取中にウイルスが崩壊する可能性があるため,4μmを超えるサイズの粒子には存在しないとは言えない

rRT-PCR対照群で観察されたpfu(プラーク形成単位)あたりの遺伝子コピー数の多さは,エアロゾルサンプルからこのウイルスを分離する際の課題についても示唆しているかもしれない.pfuあたりの遺伝子コピー数の高い比率は,培養条件下で多数の欠陥干渉(DI)粒子(defective interfering (DI) particles)が存在することを示しているのかもしれない.他のベータコロナウイルスは,培養下でDI粒子を生成することが知られている[35].さらに、同様の結果が患者サンプルでも観察されている.Scola[36]は,患者において高いウイルス量がrRT-PCRで測定できる一方で,Ct値が34を超える培養陽性サンプルは見られないことを示した.これらの事例にDI粒子が関与しているかどうかは不明だが,細胞培養でもヒトの感染でも,たとえ高力価の感染性ビリオンが存在しなくても,大量のRNAが存在することは明らかである.したがって,患者の環境ではRNAの汚染がいたるところで観察されるが,その中で感染性ウイルスを示す部分は比較的少ないかもしれない.この点を考慮して,これらのエアロゾルサンプルや他のエアロゾルサンプルに含まれるウイルスRNAの観察結果を解釈する必要がある.

Conclusion

我々の結果は,SARS-CoV-2 RNAが直径< 5µmの呼吸エアロゾルに存在すること; SARS-CoV-2 RNAを含むエアロゾルは,呼吸,発声,咳の際に発生することが実証されている粒子モードで存在すること[33]; そして,RNAを含むエアロゾルの一部には,intactで複製可能なビリオンが含まれていることを示している(Table S7).

この研究は,SARS-CoV-2伝播に微細エアロゾルが関与していることを裏付けるものであり,症状や医療行為の有無にかかわらず,感染者と接触する際には,SARS-CoV-2の微細エアロゾルへの曝露を防ぐために,効率的な呼吸器の保護(efficient respiratory protection)と空気を介した隔離予防策(airborne isolation precautions)が重要であることを強調している.

本研究の結果は,提示された他の証拠と合わせて,COVID-19の空気媒介性伝播が多くの状況で起こりうること,そして特に混雑した環境でSARS-CoV-2の感染拡大を効果的に食い止めるためにエアロゾル防止策を実施すべきであることを示唆している.

 

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