COVID-19関連追加(2021822日)(シリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2の重症度と伝播効率)

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202112日(この論文のプレプリント)

【シリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2の重症度と伝播効率は,空気を介した曝露では増加するが,fomite曝露では増加しない】

Port, J.R., Yinda, C.K., Owusu, I.O. et al. SARS-CoV-2 disease severity and transmission efficiency is increased for airborne compared to fomite exposure in Syrian hamsters. Nat Commun 12, 4985 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25156-8.

Abstract

SARS-CoV-2伝播は,接触,fomite,空気媒介性伝播によって引き起こされる.それぞれの伝播経路の相対的な寄与度については,まだ議論の余地がある.ここで我々は,シリアンハムスターが鼻腔内,エアロゾル,fomite曝露を介してSARS-CoV-2に感受性があることを明らかにした.曝露経路が異なると,疾患による症状も異なってくる.鼻腔内(IN: intranasal)およびエアロゾル播種では,重篤な呼吸器病理,より高いウイルス量,体重減少が生じる.対照的に,fomite曝露は,抗炎症性免疫状態と遅延した排出パターンを特徴とする,より軽度の疾患症状を引き起こす.呼吸器ウイルス排出量の全体的な大きさは疾患重症度とは関連がないが,排出の開始は関連がある.早期の排出は疾患重症度の増加に関連がある(早期の時点での呼吸器ウイルス排出(疾患発現前)が急性疾患発現を予測する可能性を示唆している).空気媒介性伝播の効率はfomite伝播よりも高く,気流の方向に依存する.現在進行中のSARS-CoV-2の進化に照らし合わせて,伝播や病原性の変化の可能性を評価するには,SARS-CoV-2の伝播モデルを慎重に検討することが重要である.

 

Results

臨床的な疾患重症度は曝露経路と相関関係がある:

曝露経路が疾患重症度に与える影響を調べるために,3つの異なる接種経路を比較した.4-6週齢の雌のハムスター12匹を3つのグループに分け,鼻腔内(intranasal)(I.N.; 8×104 TCID50),エアロゾル(1.5×103 TCID50),fomite8×104 TCID50)の各経路でSARS-CoV-2を播種させた(Fig.1a).比較のために,未曝露コントロールも加えた(N= 12).各群とも,播種後1日目(DPI)と4DPI4匹の動物を安楽死させ(euthanized),残りの4匹は14DPIまで観察した.I.N.またはエアロゾル経路で播種した動物は,著しい体重減少を示したが,fomite曝露では,限定的で一過性の体重減少にとどまったI.N.播種動物は3DPIで,エアロゾル曝露動物は2DPIで体重が減少し始めた(Fig.1b未曝露コントロール群と比較して,I.N.播種群では6DPI,エアロゾル播種群では4DPIにおける体重減少で有意であった(Fig. 1b; N= 4, MannWhitney test, p= 0.0286 and p= 0.0286体重減少に加え,一貫性のない一時的な軽度の無気力と毛並みの乱れが観察されたFomite曝露群は,未曝露対照群と比較して,体重増加が少なかった.14DPIの時点では,両群間に有意な差は見られなかった(Fig. 1c; N= 4, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparison test, p= 0.2953).

Fig.1: Disease severity in Syrian hamsters.

a Experimental layout for intranasal (I.N.), fomite and aerosol exposure experiments. White circle: inoculation, black: necropsy, gray, swab time-points b Relative weight loss in hamsters after SARS-CoV-2 inoculation over time (DPI = day post inoculation, N = 4 per group). The lines represent mean ± SEM. Black line indicates weights of unexposed control group. Dotted vertical line represent averaged peak weight loss post inoculation or exposure. Statistical significance was measured using a Mann–Whitney two-sided test, p-values are shown. c Violin plot with individuals and median of weight gain at 14 DPI. Statistical significance was measured using a Kruskal–Wallis test, followed by Dunn’s multiple comparison test. d Violin plot with individual and median titers of infectious SARS-CoV-2 in the respiratory and intestinal tissues at 1 DPI and e 4 DPI, Red: I.N, blue: aerosol, purple: fomite, black: unexposed; dotted horizontal line = limit of detection (0.5). GI = gastrointestinal tract; N = 4 per group. Statistical significance was measured using a two-way ANOVA, followed by Tukey’s multiple comparison test. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant. Source data are provided as a Source Data file.

 

 

Fig. 1

エアロゾル曝露により,ウイルスが上・下気道に直接沈着し,鼻腔上皮,気管・気管支上皮で複製される:

SARS-CoV-2の感染初期(1DPI)のトロピズムと複製を各曝露経路について調べた.感染性ウイルスは,すべてのI.N.曝露動物とエアロゾル曝露動物の気管(trachea)から検出された.肺では,エアロゾル曝露したすべての動物と,I.N.播種したハムスターの一部で感染性ウイルスが検出された(Fig.1d).fomite曝露群では,1DPI時点で上・下気道ともに感染性ウイルスは検出されなかった.エアロゾル曝露したハムスターは,I.N.播種ハムスターと比較すると、この時点で気管と肺のウイルス量が有意に増加していた((N= 4, ordinary two-way ANOVA, followed by Tukeys multiple comparisons test, p= 0.0115 and p=< 0.0001, respectively).このことから,エアロゾル曝露により,ウイルスの飛沫核がより効率的に下気道系に沈着することが示唆された(aerosol exposure more efficiently deposits viral droplet nuclei in the lower respiratory system).なお,播種経路にかかわらず、消化器官からは感染性ウイルスが検出されなかった.

最初の細胞トロピズムを調べるため,SARS-CoV-2複製のマーカーとしてSARS-CoV-2核タンパク質を標的とした免疫組織化学(IHC: immunohistochemistry)を1DPIでの頭蓋骨矢状断と肺切片で行った.エアロゾルを播種した動物では,鼻腔,気管粘膜,気管支粘膜にある中程度〜多数の線毛上皮細胞にウイルス抗原が観察された.また,I型およびII型肺胞上皮細胞(pneumocytes),肺マクロファージ,嗅上皮細胞にもウイルス抗原が検出された(Fig.2a, e, i, m).比較すると,I.N.曝露ハムスターの評価では,この時点で気管と肺の上皮細胞にはウイルス抗原は認めなかった.興味深いことに,1DPII.N.播種したハムスターのサブセット(N= 2/4)の肺マクロファージにウイルス抗原が検出された(Supplementary Fig. 1b).ウイルス抗原は,鼻甲介の線毛上皮および嗅上皮から検出された(Fig. 2b, f, j, m).ウイルス学的所見と同様に,fomite播種ハムスターの気管や肺からはSARS-CoV-2抗原は検出されなかった(N= 0/4).fomite播種ハムスター1匹(N= 1/4)の鼻甲介の線毛上皮細胞からウイルス抗原が検出された(Fig. 2c, g, k, m).対照組織ではSARS-CoV-2抗原は検出されなかった(Fig.2d, h, l, m).

Fig.2: Comparison of early replication of SARS-CoV-2 in respiratory tract.

Comparison of replication of SARS-CoV-2 for intranasal (I.N.), aerosol and fomite inoculated hamsters at 1 day post inoculation (DPI) by immunohistochemistry (N = 4). a–c SARS-CoV-2 antigen detection in ciliated epithelial cells of the nasal mucosa (200x; bar = 100µm). d Nasal mucosa from a control hamster (200x; bar = 100µm). eg SARS-CoV-2 antigen detection throughout tracheal ciliated epithelial cells (400x; bar = 50µm). h Normal tracheal mucosa from a control hamster. i SARS-CoV-2 antigen detection focused on terminal bronchioles and adjacent alveolar spaces (40x; bar = 500µm). j Lack of SARS-CoV-2 in epithelial cells with strong antigen detection noted in pulmonary macrophages (inset) (40x; bar = 500µm). k Lack of SARS-CoV-2 antigen detection throughout the lung (40x; bar = 500µm). l Normal lung from control hamster (40x; bar = 500µm). m Quantitative comparison of antigen detection for lung (type I and type II pneumocytes, macrophages (mos), mucosa of the trachea and skull sections (olfactory and ciliated epithelium of the nasal turbinates) at 1 day post inoculation for I.N., aerosol, fomite, and control groups.

 

 

Fig. 2

Fomites曝露は,呼吸器管での複製動態(replication kinetics)は遅延し,肺病理の重症度はより低い:

曝露経路とその後の呼吸器管病理との相関を調べるために,1DPIおよび4DPIにおいて肺,気管,鼻甲介の切片を採取し,病理組織学的評価を行った.興味深いことに,1DPIでは,播種経路にかかわらず,一部のハムスターに鼻甲介病理が観察された(Fig.3a-c).病理組織学的病変は,1DPIにおいて主に線毛上皮細胞に観察され,I.N.播種群で最も一貫して観察され,すべての播種動物(N= 4/4)で多数の変性および非変性白血球の流入を伴う軽度〜中等度の線毛上皮細胞の壊死が見られ,次いでエアロゾル播種ハムスターでは75%N= 3/4)が最小〜中等度の病変を示した.fomite播種群では,鼻甲介の病理組織学的病変が最も少なく,かつ重度ではなかった半数(N= 2/4)のハムスターは病理組織学的病変を認めず,残りのハムスター(N= 2/4)では最小限の病理組織学的病変しか認めなかった.エアロゾル播種したすべてのハムスター(N= 4/4)とI.N.播種したハムスターの半数(N= 1/2)に軽度〜中等度の気管の炎症が認められた(FIg.3e, f).気管の炎症は,fomite播種したハムスターのいずれにも見られず(N= 4, FIg.3g),このモデルでは1DPIで検出されたウイルスの力価が早期発症(early-onset)の病理学的変化に結びついていることが確認された.予想通り,播種経路にかかわらず,1DPIの時点で肺の病理学的変化は最小限であった(エアロゾルおよびfomite).肺の早期の病理組織学的病変では,稀な単細胞の気管支上皮細胞の壊死(rare single cell bronchiolar epithelial cell necrosis),稀なまたは少数の好中球の気管支粘膜への浸潤(infiltration of rare or low numbers of neutrophils into the bronchiolar mucosa),浮腫液による隔壁の最小膨張と稀な白血球の隣接肺胞腔への流出を伴う局所的な間質性肺炎(focal interstitial pneumonia with minimal septal expansion by edema fluid and spillover of rare leukocytes into the adjacent alveolar spaces)などであった(Fig.3i, j, k).

Fig.3: Comparison of the respiratory tract pathology of SARS-CoV-2 Infected hamsters.

Comparison of SARS-CoV-2 pathology for intranasal (I.N.), aerosol and fomite inoculated hamsters at 4 day post inoculation (DPI) (N = 4). a Infiltration and disruption of the ciliated nasal mucosa by moderate numbers of leukocytes with multifocal epithelial cell necrosis (200x; bar = 100µm). b Multifocal disruption of the nasal ciliated mucosa by low numbers of leukocytes with accumulations of degenerate leukocytes in the nasal passage (200x; bar = 100µm). c Intact ciliated nasal mucosa with normal mucus presence within the lumen (200x; bar = 100µm). d A control nasal turbinate with intact ciliated nasal mucosa and mucus within the lumen (200x; bar = 100µm). e Disruption of the tracheal mucosa with single cell necrosis and infiltration by low numbers of leukocytes (400x; bar = 50µm). f Unaffected tracheal mucosa (400x; bar = 50µm). g Unaffected tracheal mucosa (400x; bar = 50µm). h Section of tracheal mucosa from a control hamster (400x; bar = 50µm). il No significant histopathologic lesions in the lung of any inoculation route at 1 day-post-inoculation (100x; bar = 200µm). m Multifocal disruption of ciliated nasal mucosa with accumulation of cellular debris and degenerate leukocytes within the nasal passage (200x; bar = 100µm). n Severe disruption and multifocal erosion of the nasal mucosa with accumulation of numerous degenerate leukocytes and abundant cellular debris within the nasal passage (200x; bar = 100µm). o Ciliated epithelial cell degeneration and mucosal erosion with leukocyte infiltration into the lamina propria (200x; bar = 100µm). p Normal nasal turbinate from a control hamster (200x; bar = 100µm). q Focal disruption of the tracheal mucosa by low numbers of leukocytes (400x; bar = 50µm). r Multifocal infiltration of the mucosa by moderate numbers of leukocytes and multifocal epithelial cell necrosis (400x; bar = 50µm). s Multifocal loss of epithelial cilia and infiltration of the lamina propria by moderate numbers of leukocytes (400x; bar = 50µm). t Normal tracheal mucosa from a control hamster (400x; bar = 50µm). u Widespread, moderate to severe broncho-interstitial pneumonia (100x; bar = 200µm). v Multifocal moderate broncho-interstitial pneumonia focused on terminal bronchioles (100x; bar = 200µm). w Multifocal, mild interstitial pneumonia focused on terminal bronchioles (100x; bar = 200µm). x Normal lung from a control hamster (100x; bar = 200µm). y, z Clustering (Euclidean, complete) of animals based on viral titers in lung and trachea and quantitative assessment of pathology in the upper and lower respiratory tract on 1 DPI and 4 DPI. Heatmap colors refer to color scale on the right, gray = NA, I.N. = red, Aerosol = blue, Fomite = purple, Control = black. Exposure route is indicated by color bar at the top. Source data are provided as a Source Data file.

Fig. 3

4DPIまでに,播種経路にかかわらず、すべての動物の肺で感染性ウイルスを検出することができた.I.N.播種動物とエアロゾルまたはfomite曝露動物との間には有意な差は認められなかった(Fig. 1d; N= 4, ordinary two-way ANOVA, followed by Tukeys multiple comparisons test, p= 0.4114 and p= 0.9201, respectively).また,播種経路にかかわらず,すべての評価対象ハムスターにおいて,鼻甲介および肺の病理重症度が増加した.興味深いことに,エアロゾルとI.N.播種のいずれの経路でも,鼻甲介内(within)の嗅上皮領域がより深刻に侵されていた.これは,ウイルスが最初に線毛上皮に付着して複製された後,疾患が進行する過程でより尾側(caudal)の嗅上皮が標的となったことを示唆している(Fig.3m-o).この時点では,fomite播種したすべての動物に鼻粘膜病変が認められた.しかし,I.N.およびエアロゾル播種群と比較して病理は軽度であり,主に線毛粘膜領域に集中していたことから,エアロゾルおよびI.N.播種群と比較して疾患進行が遅延していることが示唆された.気管の炎症はすべての播種経路で観察され,最小〜軽度まで様々であった(Fig.3q-s).以前に報告されたシリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2感染症24)と同様の中等度の肺病変が,4DPIの時点でエアロゾル播種およびI.N.播種動で観察されたが(Fig.3u, v),fomite播種群では重度ではなく,一貫した病変も観察されなかった(Fig.3w).病変は,終末細気管支を中心とし隣接する肺胞にまで及ぶ中程度の気管支-間質性肺炎(broncho-interstitial pneumonia)であった.間質性肺炎は,浮腫液,フィブリン,中程度の数のマクロファージ,より少ない好中球による肺胞隔壁肥厚が特徴であった.この群では,肺の病理学的病変は最小〜中程度の範囲で一貫していないが,これは,4DPIの時点で一部のfomite曝露動物が肺に高いウイルス量を示したという観察結果と一致する(Fig.3w).対照動物では,1DPIおよび4DPIにおいて,病理組織学的に有意な病変は観察されなかった(Fig. 3d, h, I, p, t, x).

1DPI4DPIの肺病理パラメータ(細気管支炎,間質性肺炎,気管炎,線毛上皮および嗅上皮病理)を,観察されたウイルス力価と関連させて階層的にクラスタリングすると,1DPIの気管の呼吸器病理と,気管および肺のウイルス量との間には明確な関係が存在し,一方,鼻上皮病理との関係はより離れていた(Fig.3y).注目すべきことに,4DPIにおける肺のウイルス量が,間質性肺炎の発現と最も密接に関連していたことである.fomite曝露動物は,1DPIでは,未曝露対照群と最もよく類似していたが,4DPIでは気管炎が出現し,明確な下気道病変を伴わない線毛上皮病理が見られたため,別の群に分類された(Fig.3z).このことは、fomite曝露は,気道にウイルスを直接深く沈着させた場合(エアロゾル播種)と比較して,気道での複製動態が遅延し,4DPIでの肺病理がより重症でなくなることを意味する

 

 

Fomites曝露は結果として,肺における免疫プロファイルを低下する:

全身の免疫応答を調べるために,4DPIでの血清でサイトカイン特異的ELISAを行った(Fig.4a).全体的に有意性は低かったが,炎症性腫瘍壊死因子(TNF)-α,抗炎症性インターロイキン(IL)-4およびIL-10については,曝露経路によって血清レベルが異なっていた,未曝露群,I.N.群,エアロゾル群とは対照的に,fomite曝露群では4DPITNF-αレベルが低下し,I.N.群とfomite曝露群の間に血清レベルの有意差が認められた(N= 4, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparisons test, p= 0.0360).逆に,IL-4レベルはすべての群で未曝露動物と比較して増加したが,fomite曝露動物で最も高いレベルが見られ,未曝露群とfomite群の間の差は統計的に有意であった(N= 4, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparisons test, p = 0.0109).また,血清IL-10の増加は,fomite曝露動物およびI.N.曝露動物で観察されたが,エアロゾル曝露後の動物では減少が観察され,エアロゾル曝露ハムスターとfomite曝露ハムスターとの間に有意差があった(N= 4, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparisons test, p = 0.0286).有意ではないが,未感染動物と比較して,インターフェロン(INF-γの血清レベルが低下する傾向が見られた.IL-6の血清レベルには有意な差は見られなかった.

Fig.4: Exposure dependent SARS-CoV-2 acute local immune gene activation, systemic cytokine response and strength of humoral response.

a Violin plots with individuals and median of serum concentrations of key cytokines (interferon (IFN)-γ, tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6, IL-4, and IL-10) on 4 days post inoculation (DPI). Statistical significance was measured using a Kruskal–Wallis test. b, c Violin plots with individuals and median of endpoint IgG antibody titers against SARS-CoV-2 spike ectodomain measured by ELISA in serum and reciprocal live virus neutralization titers. ELISAs and neutralization assays (VNs) were done once. d Selection of significantly up- (brown) or downregulated (blue) immune- or infection associated pathways in the lung at 4 DPI, identified by integrated pathway analysis. e Clustering (Euclidean, Ward.D2) of animals based on gene-expression associated with the coronavirus pathway (left) and Th1/Th2 pathway (right) in lung at 4 DPI. Heatmap colors refer to color scale on the right (normalized z-score). Exposure route is indicated by color bar at the top, I.N. = red, Aerosol = blue, Fomite = purple, Control = black. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant. Source data are provided as a Source Data file.

 

 

Fig. 4

曝露経路にかかわらず,14DPIの時点ですべての曝露動物がセロコンバージョンを起こし,ELISAで測定したSARS-CoV-2スパイクを標的とする抗体の存在が確認された(Fig.4b).液性応答の大きさは曝露経路に関連していた.I.N.曝露は,fomite曝露と比較して最も強く,有意に高い抗体応答を示した(N= 4, Kruskal-Wallis test, and following Dunn's multiple comparisons test, p= 0.0209).I.N.曝露およびエアロゾル曝露動物の間には有意な差は見られなかった.我々は,live virusに対する中和能力を比較した.エアロゾル曝露動物は最も高い中和力価を示し,fomite曝露動物は最も低い中和力価を示したが,有意な差はなく(Fig. 4c, N= 4, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparisons test, p= 0.2026),中和力価とELISA力価の比も同様に差がなかった(Supplementary Fig. 1e).

肺における局所的な免疫応答を把握するため,対照動物と比較して,1DPIおよび4DPIにおける遺伝子発現のグローバルな変化(global changes)を評価した.なお,3つの肺サンプルは品質上の問題から除外した(Supplementary Table 1).主成分分析の結果,ほとんどの条件で群別が行われ,各群には関連する複製が含まれていた.最も分離が大きかったのは1DPIおよび4DPIのエアロゾルサンプル群で,残りの6つの条件では分離が少なかった.しかし,残りの6つの条件の2番目のクラスターの中には,2標準偏差(2SD)を表す楕円が残っており,対照群とは異なる交差しない群と見なすことができる(Supplementary Fig. 2).

曝露経路ごとにどの経路が異なって制御されているかを評価するため,遺伝子発現情報を統合経路解析(IPA: Integrated Pathway Analysis)ソフトウェアに取り込んだ.その結果,I.N.曝露およびエアロゾル曝露群では,50以上のカノニカルパスウェイが対照群と比較して有意に上昇または下降した(p-value< 0.05, z-score< −2 or > 2).その中には,代謝,免疫,感染および細胞機能に関連するパスウェイが含まれていた(Fig. 4d, Supplementary Table 2 shows all significant pathways).fomite動物では,対照動物と比較して有意に上昇または下降したパスウェイは10個のみであった,I.N.曝露およびエアロゾル曝露動物では,パスウェイ分析により,マクロファージ活性化,樹状細胞の成熟,インターフェロンのシグナル伝達,T-B-NK-細胞の関与が明らかになった.fomite曝露動物では,インターフェロンシグナル,Th17経路,細菌やウイルスのパターン認識が上昇していた.興味深いことに,Th17経路の関与は3つすべてに見られた.

我々は4DPIの動物の肺で同様のウイルス力価が確認したので,次にIPAを用いて,ウイルス誘発性応答(コロナウイルス経路, coronavirus pathway)とその結果としての獲得免疫応答(Th1/Th2経路)をより詳細に比較した(Fig.4e).エアロゾル曝露およびI.N.曝露動物では,コロナウイルス経路に関連する遺伝子の発現や制御に違いが見られたI.N.暴露動物と比較して,4DPIでのエアロゾル曝露は,MAVSELK1BCL2Serpine 1およびIFNAR1を含む複数の主要なメディエーターの発現を低下させたが,IL-1bの発現は上昇したそれに比べて,コロナウイルス経路関連遺伝子の大きな発現の違いは,fomite曝露動物では見られなかった.詳しくみると,I.N.曝露およびエアロゾル曝露動物に見られるTh1/Th2経路のアップレギュレーションは,特に炎症性サイトカインIL-18IFN-γ,IL-6IL-2遺伝子発現を増加させ,表面分子CD4およびCD8CD28CD80CD40などの複数の共活性化分子(multiple co-activation molecules),CXCR3CXCR6CCR8ITGB2などのケモカイン受容体と組織輸送受容体(chemokine receptors and tissue trafficking receptors)の発現を増加させた.対照的に,fomite曝露動物では,発現量の増加はほとんど見られず,対照に最も近い場所に集まっていた以上のことから,肺におけるfomite曝露後には,エアロゾル曝露と比較して穏やかな免疫応答が起こり,重篤な結果から保護される可能性があると考えられる

ウイルス排出は曝露経路に依存する:

スワブのsgRNAの検出は,SARS-CoV-2の活発な複製を示す.活発に複製しているSARS-CoV-2のみがRNA合成を開始し、結果としてsgRNAの複製および転写を引き起こすからである(Wang Y, 2020; Kim, 2020).

 

シリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2の経路依存的なウイルス排出パターンを理解するために,7DPIまでは毎日口腔咽頭と直腸のスワブを採取し,その後は週に3回スワブを採取した(Fig. 5a, b, Supplementary Fig. 1f).口腔咽頭スワブは呼吸排出を,直腸スワブは腸管排出を測定している.ウイルス複製マーカーであるウイルスsgRNA 27)は,少なくとも1日に渡って,すべての曝露動物の両スワブから検出された.曝露経路間で呼吸排出プロファイルを比較したところ,異なるパターンが観察された.I.N.播種では,1DPIから高いウイルス量が得られ,6DPIまで続いたが,その後sgRNAレベルは減少し始めた。エアロゾル播種群では,2DPIでウイルス排出ピークに達し,その後すぐにウイルスsgRNAレベルが低下した.対照的に,fomite曝露動物は,エアロゾルおよびI.N.群とは異なる排出動態を示し,数日間にわたってウイルスsgRNA排出が増加し,5DPIで排出がピークに達した.I.N.群とfomite群では,ピーク時の排出が多い傾向が見られたが,有意な差は認められなかった(Fig.5c; N= 4, Kruskal-Wallis test, and followed by Dunn's multiple comparisons test, p= 0.8400).一方,腸管排出では,中央値で低いウイルス量を示したが,群間に有意差はなかった: N= 4 Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較検定を行い,p= 0.1512とした(Fig.5b, d).群間での動物の排出プロファイルを見ると,腸排出は最大で3日間連続して観察され,ほとんどの陽性動物ではスワブからsgRNA1日または2日連続でしか検出されなかった.各曝露経路で発生した全体的な排出量を評価するため,14DPIまでの累積排出量(曲線下面積(AUC))を比較した.エアロゾル曝露では,I.N.およびfomite曝露と比較して,口腔咽頭スワブ中のウイルスRNAが全体的に少なかった(N= 4, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparisons test, p= 0.0263).対照的に,エアロゾル曝露動物の直腸スワブでは,ほとんどの累積ウイルスsgRNAが検出された(Fig.5d).これらのデータを総合すると,疾患重症度は,感染後に排出されるウイルスの期間と累積量を示すものではないことが示唆される

Fig.5: Exposure dependent SARS-CoV-2 shedding.

a Respiratory and b intestinal viral shedding of intranasal (I.N.), aerosol and fomite exposed hamsters. Median, 95% CI and individuals are shown. c Peak shedding and d cumulative (area under the curve (AUC) analysis) respiratory and intestinal shedding of I.N., aerosol and fomite exposed hamsters. Statistical significance was measured by Kruskal–Wallis test, N = 4 per group. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant. e Correlation between cytokine levels, early shedding (2 days post inoculation (DPI)), peak shedding, peak weight loss, ELISA and virus neutralization (VN) titers (14 DPI), lung titers and pathology at 4 DPI. Significant correlations (N = 4 per group, Pearson–Spearman analysis, p < 0.05) are indicated with an asterisk and strength of correlation (R2) is depicted according to the color bar on the right. Source data are provided as a Source Data file.

Fig. 5

 

 

早期の排出プロファイルが疾患重症度と対応する免疫応答を予測する:

我々は曝露経路によって疾患プロファイルへの影響が異なることを観察したため,次に早期の排出パターンによる疾患の予測可能性を調査した.早期排出(2DPI,ピーク排出,ピーク体重減少,4DPIでの肺ウイルス力価と病理,14DPIでの抗体力価と中和能,の間の相関関係に,免疫状態を測定するためのサイトカイン応答(4DPI)を加えた(Fig.4e).肺のウイルス力価は,2DPIの口腔咽頭スワブから検出されたウイルスRNA量と有意に正の相関を示した(Spearman correlation test, N= 12, p= 0.047肺力価は,上・下気道の病理や体重減少と正の関係を示したこのことから,早期での呼吸排出(疾患の発現前)が、急性疾患の症状を予測する可能性が示唆された

IL-4IL-6IL-10の血清レベルは,疾患重症度のパラメータとの間に有意な相関関係は見られなかった; しかし,相関関係には明確な負の関係が見られたTNF-αは,IL-4およびIL-10レベルと負の相関を示した(Spearman correlation test, N= 12, p= 0.048 and p= 0.008, respectively).早期の直腸排出,TNF-αの血清レベルと嗅上皮病理(olfactory pathology)の間には正の相関が認められた(Spearman correlation test, N= 12, p= 0.0002 and p= 0.001, respectively).興味深いことに,嗅上皮病理もIgG応答の大きさと中和能力に正の相関を示した(Spearman correlation test, N= 12, p= 0.001 and p= 0.021, respectively)(Fig.5e).

シリアンハムスターでは,空気媒介性伝播はfomite伝播よりも効率が良い:

ケージのウイルスfomite汚染を調べるために、1匹のI.N.播種ハムスターを入れたケージの表面から,7DPIまで毎日スワブを採取した(Supplementary Fig. 1c, d).gRNAはすべてのサンプルで,1DPIで検出され,sgRNA7/887.5%)の寝具サンプルと3/837.5%)のケージサンプルで検出され,8/8ケージにおいては両サンプルとも2DPIで検出された.ウイルスsgRNAは,7DPIまでは高濃度で検出され,2および3DPIでピークが見られたことから,ケージ環境が強固に汚染されていることが示唆された

fomite伝播の潜在的リスクを評価するために,2匹のI.N.感染動物を4日間収容した後,センチネルハムスターをケージに導入した(Fig. 6a).センチネル動物には病気の兆候や体重減少は見られなかったが,汚染されたケージへの曝露から21日後(DPE)に8匹のうち4匹でセロコンバージョンが見られ(Fig.6h),ハムスターからハムスターへのfomiteを介した間接伝播が起こりうることが確認された(Fig.6h

Fig.6: Fomite and airborne transmission in the Syrian hamster.

a Experimental layout for fomite and b airborne exposure experiments in hamsters. I.N. = intranasal. c Pictures of smoke test to demonstrate unidirectional airflow in the transmission cage. d Aerodynamic particle size distribution on either side of the transmission cage. e Reduction of particles by the divider. f, g Relative weight loss in hamsters after SARS-CoV-2 transmission via fomite and airborne routes. DPE = days post exposure. Lines represent mean ± SEM. h Violin plot with individuals and median of endpoint IgG antibody titers against SARS-CoV-2 spike ectodomain by ELISA in serum of hamsters infected through airborne and fomite transmission route. ELISAs were done once. i Respiratory shedding profile of hamsters exposed through fomite and airborne transmission routes, individuals, median and 95% CI are shown. j Cumulative (area under the curve (AUC) analysis) of respiratory shedding from animals which seroconverted after airborne and fomite transmission. Violin plots with individuals and median are depicted. Statistical significance was measured by Kruskal–Wallis test, N = 8 per group. *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.0001, ****P < 0.0001. NS, not significant. Source data are provided as a Source Data file.

 

 

Fig. 6

次に,ハムスターからハムスターへの空気媒介性伝播の効率と動態を評価した.この目的のために,ケージの仕切りを設計し,空気は流れるが,動物間の直接接触あるいはfomite伝播はできないようにした(Fig. 6b, c, d, and Supplementary Movie 1).我々は粒子計測器を用いて,ケージの仕切りが粒子の流れを遮断する効果を評価した.その結果,より小さい粒子(<10µm)のクロスオーバーは約60%遮断され,一方,より大きい粒子(>10µm)はセンチネル側で85%を超えて減少した(Fig.6d, e

最初の実験では,1匹のセンチネルハムスターを,1匹の感染動物から下流の仕切り板側に配置した(N= 8).エアロゾル化したウイルスに直接曝露した動物とは対照的に,センチネル動物のいずれにも病気の兆候や体重減少は見られなかった(Fig.6g).しかし,すべての動物がセロコンバージョンを獲得した.気流の方向性の重要性を評価するために,センチネルを空気の流れに逆らって配置した4組の感染ペアについても,空気媒介性伝播モデルを作成した(Fig.6b, c).気流に逆らって配置されたセンチネルの4匹のうち1匹だけがセロコンバージョンした(Fig.6hこのことによって予想通り,気流の方向性が空気媒介性伝播の鍵となることが示唆された21DPI/DPEでの抗体応答を比較すると,ドナーのI.N.播種動物と,空気媒介性伝播後にセロコンバージョンを起こした動物(100%)との間には有意な差は認められなかったが,fomite伝播後にセロコンバージョンを起こした動物(50%)の力価は低かった(Fig. 6h, KruskalWallis test, followed by Dunns multiple comparisons test, N= 8 and N= 4, p=> 0.9999 and p= 0.2488, respectively.力価は,直接I.N.播種した後に観察されたものと同等であった.以上のことから,ハムスターからハムスターへの空気媒介性伝播では,無症候性疾患が発現しても,液性免疫記憶は同等に強固であることが示唆された

fomiteあるいは空気媒介性伝播後の動物による伝播リスクを調査するため,呼吸排出プロファイルを決定した.センチネルハムスター8匹のうち4匹が,汚染されたケージに複数日連続して曝露された後,ウイルス排出が確認された.直接fomite曝露したハムスターと同様に,排出は1DPEに観察され,4/5DPEにウイルスsgRNAのピークが見られた(Fig.5a空気媒介性伝播の場合,気流の下流にいるセンチネルは,1DPEまでに排出を開始し,8匹すべての動物は,2DPEまでに口腔咽頭腔内に多量のウイルスsgRNAを認め,6DPEまで高値を維持したこのデータは,この間接的な曝露経路が,エアロゾルによる直接曝露とは明らかに異なる疾患症状と排出プロファイルを示すことを示唆している(Fig.6i注目すべきは,空気媒介性曝露した動物の間でのウイルス排出量は,fomite伝播を介して感染した動物と差がなかったことである(Fig.6jこれらのデータは,疾患フェノタイプがないか非常にわずかであるにもかかわらず,動物間の間接的な曝露経路はいずれも無症候性キャリアを模倣していることを示唆している

 

Discussion

SARS-CoV-2の最初の呼吸器トロピズムは曝露経路によって決定され,エアロゾル曝露によりSARS-CoV-2は上・下気道の両方に効率よく沈着した.その結果,SARS-CoV-2の複製動態は,I.N.播種動物と比較して,感染早期に気管と肺で高いウイルス力価を示した.I.N.接種動物の1DPIにおける気管組織のPCRSARS-CoV-2 RNAが検出されたが,この時点でのIHCではSARS-CoV-2 Nタンパク質抗原は検出されなかった.これにはいくつかの要因が考えられる: 分子学的およびウイルス学的解析のために採取した近位気管は,播種部位に物理的に最も近い部位である.この部位は,播種量に近かったため,より急速に感染した可能性がある.さらに,IHCは特異性の高いアッセイとなるが,ウイルス抗原がほとんど生成されていない前急性期(pre-acute phase)には感度が低い可能性がある.ハムスターにエアロゾル播種したところ,接種量が10倍少ないにもかかわらず,I.N.接種に比べて肺でのウイルス複製が急速に進み,体重が減少した.一方,fomite播種した場合は,曝露から肺でのウイルス複製までの時間が長くなり,疾患重症度が低下した.この遅延は,fomite播種の場合,ウイルスの複製は吸入される前に口腔咽頭で起こる可能性を示唆している32).したがって,最初の免疫プライミングは下気道では起こらず,全身的なTNF-αの不足を特徴とする調節免疫応答のための時間が必要である可能性がある.TNF-αの減少は,4DPIで観察されたウイルス力価が,エアロゾル播種と比較して有意に低くなくても,肺の免疫病理を減少させる可能性がある.IL-10IL-4は,分化し感染経路に依存した方法で制御されている可能性があることが以前に示されており,今回のこれらのサイトカインの全身的な存在の違いを説明することができる34).しかし,サイトカインプロファイルの全身的な分析は,ハムスターに特異的な試薬を入手できなかったために大きく制限され,表面的なものにとどまった.4DPIにおけるlocal transcriptomeに関する我々のデータは,エアロゾル曝露およびI.N.曝露がコロナウイルス経路関連遺伝子の主要かつ多様な関与をもたらし,Th1およびTh2応答経路の遺伝子サブセットのアップレギュレーションを増加させたことを示しているが,一方で,この時点でのfomite曝露による経路活性化は最小限であった.このことは,これらの動物に病理学的な増加が観察された理由を説明するものである.以前,ハムスターのsingle-cell analysisにより,ウイルスの除去に先立って,炎症そしてCD4+およびCD8+細胞傷害性T細胞応答が起こることが示された35).エアロゾル曝露やI.N.曝露後に見られる遺伝子発現プロファイルは,多くのT細胞,NK細胞,マクロファージが感染部位へ動員し,液性応答が活性化されたことを示唆している.興味深いことに,fomite接種動物は依然としてかなりの液性応答を示しており,このことは,これらの動物の免疫応答が肺外の感染によって引き起こされていることをさらに示唆していると考えられる.このような免疫特性の違いが,単に用量−動態の結果だけでなく,曝露経路の本質的な影響であるとすれば,これは新しい変異ウイルスの再感染の状況において重要な意味を持つ可能性がある.しかし,これらの直接曝露実験は培養ウイルスを用いて行われたものであり,粒子/感染性の比率が自然に排出されたサンプルで見られるものとは異なる可能性を否定できないことを我々は認識している.さらに,I.N.およびエアロゾルによる曝露量は正確に決定できたが,フォマイトによる正確な曝露量は確認できなかったことに注意が必要である.このモデルを用いた以前の研究では,疾患重症度と排出プロファイルは,I.N.曝露後の感染量によって明らかな影響を受けないことが実証されているが24),エアロゾルおよびfomite曝露後の用量−依存性が異なることを確認することはできない.

伝播経路がCOVID-19重症度に及ぼす影響については,現在のところヒトでのデータはない.ヒト以外の霊長類を対象としたニパウイルス感染実験では,粒子の大きさが疾患症状に直接影響した.エアロゾルに曝露すると急速に呼吸器疾患が進行するのに対し,大きな飛沫(large droplet)に曝露すると,顕著な呼吸器疾患の特徴を伴わない長期の疾患経過をたどる36)37).これらの結果から,重症の場合は下気道に直接ウイルスが沈着するのに対し,軽症の場合は上気道で最初のウイルス複製が起こることが示唆される.このことは,ウイルス量の低下に加えて,フェイスカバーなどの介入手段が,ウイルス粒子の下気道への沈着を制限することで,疾患を最小限に抑えることができることを示唆している38)39)40).この現象が起こるかどうかを検証するには,さらなる調査が必要である41)

我々のデータは,疾患重症度と排出時間の間に明確な相関関係が見られなかったヒトでの知見を反映している.エアロゾル曝露動物は,累積排出ウイルス量が少なかったが,fomite曝露動物は,I.N.播種動物と比較して,ウイルス排出量のピークが同じくらい高かった.ヒトでは,血清学的分析によると,感染の約17%は軽症〜無症候性のままであることが示唆されている42).無症候性と症候性どちらも排出を示す証拠があり43)44)45)46),軽症または無症候性疾患は,重症COVID-19症例と同様の伝播リスクがあることが示唆されている47)48).ヒトの無症候性疾患は,排出量が少ないか,その減少が早い可能性があるが5),今回の動物モデルでは観察されなかった.

SARS-CoV-2の感染拡大に対する,fomiteおよび空気媒介性伝播の相対的な寄与については,いまだに論争が続いている49).以前,シリアンハムスターを使った限定的な研究では,空気媒介性伝播と比較して,fomite伝播リスクは低いと評価された.fomite伝播は,ウイルスRNAのピーク時に汚染されたケージに入れられた3匹のセンチネルのうち,わずか1匹で発生した25).驚くべきことに,我々は,以前に示され25),環境汚染が軽減されると予想される場合には,感染性ウイルスの排出ピークが弱まった場合,fomite伝播が依然として発生する可能性がある(8匹のうち4匹)ことを示した.重要なのは,パンデミックのこの段階で空気媒介性伝播の関与についての理解が深まったとしても,ヒトでのfomite伝播のリスクを過小評価すべきではないということである.汚染された表面や空気からウイルスサンプルを培養する試みはかなり行われているが,検出されたウイルスRNAと実際に分離されたlive virusとの間には大きな相違がある8)14)50).これは,効率的な培養法がないことや,PCR法に基づいて環境中のウイルス負荷(viral environmental burden)を過大評価した結果かもしれない.我々がハムスターケージ内の環境汚染をPCR法で評価したところ,ドナーによる感染性ウイルスの排出が停止したと考えられる後でも,一貫して高い値を示していたことから25),培養可能なウイルスが検出されない場合でも,伝播リスクの可能性を示唆しているかもしれない.さらに,ハムスターと人間の潜在的なfomiteに対する相互作用は同じではないことも認識する必要がある.本研究で示されたfomite曝露リスクは,ヒトにとっても潜在的に汚染された表面との触覚的な相互作用を減らすことが重要な役割であることを強調している.さらに,手洗いや表面の定期的な汚染除去などの対策を講じることで,感染のリスクを低減できる可能性がある51).特に,fomite伝播は,fomiteとエアロゾルを発生させる処置が組み合わさった院内環境で発生しやすく,感受性の高い病院集団ではさらに拡大する可能性がある52)53)

今回の感染伝播実験環境では,最も大きな粒子(>10µm)を選択的に減少させることができたが,この排除は絶対的なものではなかった(Fig.5).したがって,真のエアロゾル伝播(飛沫核<5µm),飛沫伝播(>10µm),あるいはこれら2つの組み合わせを正式に区別することはできない.これまでの研究では,SARS-CoV-2は,フェレットモデルでは近距離および中距離で空気媒介性伝播することが示されている54)55).そしてハムスターでは近距離で伝播することが示されている25)56).今回の研究では,センチネルの100%が感染するという高い効率の空気媒介性伝播を示すことができた.未感染動物から感染動物への気流を逆にすると,感染伝播が急激に減少することが観察された.このことから,SARS-CoV-2伝播には方向性のある気流が重要な役割を果たしていると考えられる.このことは,ヒト−ヒトへの伝播イベントでも観察されており,レストランなどの限られた空間での伝播が気流によって誘導されていた16)57)58).方向性のある気流と逆方向の気流を用いた実験の結果は,換気の改善に焦点を当てた先制的なSARS-CoV-2対策を裏付ける直接的な実験データとなっている59)60)

本研究では,空気媒介性伝播とfomite伝播の相対的な寄与と,曝露経路が疾患に与える影響を示した.ハムスターの伝播モデルは,SARS-CoV-2ウイルスの進化が続いていることを考慮すると61),新規SARS-CoV-2株の伝播と病原性の可能性を評価する上で極めて重要である.さらに,この研究は,ヒトからヒトへの伝播を阻止することを目的とした,効果的な公衆衛生対策の開発を可能にする.

本研究では,空気媒介性伝播とfomite伝播の相対的な寄与と,曝露経路が疾患に与える影響を示した.ハムスターの伝播モデルは,SARS-CoV-2ウイルスの進化が続いていることを考慮すると61),新規SARS-CoV-2株の伝播と病原性の可能性を評価する上で極めて重要である.さらに,この研究は,ヒトからヒトへの伝播を阻止することを目的とした,効果的な公衆衛生対策の開発を可能にする.今回の研究結果は,進化したウイルス株の伝播可能性や病原性を正確に評価するためには,より自然な伝播経路を用いることが非常に適していることを示唆している61).現在,B.1.1.7B.1.351などの新しい変異ウイルスが,古くから流通していた変異ウイルスに取って代わっている.ヒトでの排出パターンから,伝播性の増加は,hACE2との結合能力や複製能力の増加だけではない可能性が示唆されている62)63)64).これらの変異ウイルスの環境安定性が異なることが明らかになった場合,これが曝露経路に影響を与えるかどうかについても調査することが賢明であろう.さらに,これらのデータは,空気媒介性伝播の真の限界を調査し,マスクを使った短距離の空気媒介性伝播について既に実証されているように,これを予防研究に応用するには,シリアンハムスターモデルが非常に適していることを強く示唆している56).さらに,ハムスターからハムスターへの自然感染伝播を異なる経路で実証したことは,このモデルが異なる伝播経路を含む複雑な介入実験の設定に有用であることを示している.

References

省略.