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NTD感染性増強抗体とDelta 4+について

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新型コロナウイルス感染症まとめver3-2202177日)ADEについて

SARS-CoV-2 Delta変異は,野生型スパイクワクチンに対する完全な耐性を獲得する

準備が整っている】

Liu Y,…,Arase H. The SARS-CoV-2 Delta variant is poised to acquire complete resistance to wild-type spike vaccines. bioRxiv. Posted Aug 23, 2021.

https://doi.org/10.1101/2021.08.22.457114.

Abstract

mRNAベースのワクチンは,SARS-CoV-2のほとんどの一般的な変異ウイルスに対して効果的な防御を提供する.しかし,今後のワクチン開発においては,ブレイクスルー変異ウイルスを特定することが重要である.本研究では,Delta変異ウイルスが,抗N末端ドメイン(NTD)中和抗体から完全に逃れる一方で,抗NTD感染性増強抗体への反応性を高めることを発見した.Pfizer-BioNTech社のBNT162b2免疫血清はDelta変異ウイルスが,Deltaウイルスの受容体結合ドメイン(RBD)に4つの共通変異を導入すると(Delta 4+),BNT162b2免疫血清の一部が中和活性を失い,感染性が増強された.BNT162b2免疫血清の感染性増強には,Delta NTDにおいて唯一の変異(unique mutations)が関与していた.野生型スパイクではなく,Deltaスパイクで免疫したマウス血清は,感染性を高めることなく,一貫してDelta 4+変異ウイルスを中和した.GISAIDデータベースによると,3つの類似したRBD変異を持つDelta変異ウイルスが既に出現していることから,このような完全なブレイクスルー変異ウイルスを防御するワクチンを開発することが必要であると考えられる.

 

Results

Neutralizing activity of anti-NTD and anti-RBD monoclonal antibodies from COVID-19 patients against the Delta variant:

SARS-CoV-2 Delta変異の感染性増加のメカニズムを理解するために,COVID-19患者から得た各種の抗スパイクモノクローナル抗体とDeltaスパイクタンパク質との結合を解析した(Figure 1A).これらのモノクローナル抗体は,SARS-CoV-2変異ウイルスがまだ出現していない時期である2020年半ばに感染した患者から得られたものであるため,現在のワクチンで使用されているものと同じ野生型スパイクタンパク質によって惹起されたと考えられる(Brouwer et al., 2020; Chi et al., 2020; Li et al., 2021; Robbiani et al., 2020; Suryadevara et al., 2021; Zost et al., 2020).中和抗体の多くはRBDに対するもので,Delta変異はこのドメインにL452RT478Kという2つの変異を持っている.L452は,ほとんどではないが一部の中和抗体のエピトープであることが報告されている(McCallum et al., 2021; Wang et al., 2021b)T478KACE2結合部位(ACE2 binding site)に位置し,主にACE2結合親和性の増加に関与していると思われる(Xu et al., 2021).様々な抗RBD抗体を用いた解析では,Deltaスパイクを認識できなかった中和抗体はわずかで、ほとんどの抗RBD中和抗体は野生型スパイクと同等のレベルでDeltaスパイクに結合することがわかった(Figure 1A).

Delta変異はNTDにおいて,T19RG142DE156GF157delR158delといういくつかの唯一の変異(unique mutations)を有しており,野生型スパイクで誘発されるいくつかの抗NTD中和抗体の結合が阻害されている可能性を示唆している.報告されている13の抗NTD中和抗体 (Chi et al., 2020; Li et al., 2021 ; Liu et al., 2020; Suryadevara et al., 2021; Voss et al., 2021)に加えて,我々はCOV2-2016COV2-2026COV2-2150も野生型スパイクに対する抗NTD中和抗体であることがわかった(Figure 1B).これら16の抗NTD中和抗体を解析したところ,いずれの抗NTD中和抗体もDeltaスパイクを認識できなかった(Figure 1A).一方,抗NTD感染性増強抗体(Li et al., 2021; Liu et al., 2021b)の結合を解析したところ,10の抗NTD感染力増強抗体のうち8つが,野生型スパイクと同等のレベルでDeltaスパイクに結合した(Figure 1A).中和抗体/増強抗体のいずれの特徴もよくわからない抗NTD抗体の中には,野生型スパイクと比較してDeltaスパイクへの結合が部分的または完全に減少したものもあれば,強い結合を示したものもあった.Delta変異に対する抗NTD抗体の認識が低下または増強する頻度が高いことから,NTDの抗原性がNTDの変異によって大きく影響を受けていることが示唆された.

次に我々は,Deltaスパイクタンパク質(Delta疑似ウイルス)または野生型スパイク(野生型疑似ウイルス)を搭載した疑似ウイルスを用いて,Delta変異に対する増強抗体および中和抗体の機能を解析した(Figure 1B-1D).各疑似ウイルスのウイルス力価は,ACE2をトランスフェクトしたHEK293T細胞への感染性で確認した(Figure S1).

Deltaスパイクに結合した抗RBD中和抗体は,Deltaおよび野生型のいずれの疑似ウイルスの感染も完全に中和した(Figure 1C).試験した抗NTD中和抗体はすべて,Deltaスパイクタンパク質を認識できなかった(Figure 1A).予想通り,これらの抗NTD抗体はDelta疑似ウイルスの感染を中和しなかったが,野生型疑似ウイルスの感染性を低下させた(Figure 1B).野生型疑似ウイルスに対する抗NTD中和抗体の中和効率は,これまでに報告されているように,抗RBD中和抗体の中和効率よりも低かった(Chi et al., 2020; Li et al., 2021 ; Liu et al., 2020; Suryadevara et al., 2021; Voss et al., 2021).増強抗体は,RBDのオープンフォームを誘導することにより,SARS-CoV-2の感染性を高める(Liu et al., 2021b).上述したように,ほとんどの増強抗体による認識は,Delta変異ではよく保存されていた(Figure 1A).また,増強抗体の効果を解析したところ,いくつかの増強抗体によるDelta疑似ウイルスの感染性増強は,野生型疑似ウイルスの感染性増強よりも大きかった(Figure 1D).これらのデータから,Delta変異は,機能的な増強抗体エピトープを維持しながら,抗NTD中和抗体から完全に逃避していることが示唆された.増強抗体は,抗RBD中和抗体の効果を低下させるため (Li et al., 2021; Liu et al., 2021b)Delta変異は,増強抗体の結果として,抗RBD中和抗体の存在下でも感染性を維持している可能性がある.

Neutralizing activity of BNT162b2-immune sera against Delta variants:

我々は次に,Pfizer-BioNTech BNT162b2 mRNAワクチンで完全に免疫された健康な人の20の血清のDelta疑似ウイルスに対する中和活性を解析した(Figure 2A).ほとんどのBNT162b2免疫血清は,高濃度でDelta疑似ウイルスの感染を完全に阻止したが,Delta疑似ウイルスに対するBNT162b2免疫血清の中和力価は,野生型疑似ウイルスと比較して著しく低下し(Figure 2B),以前の報告と同様であった(Liu et al., 2021a; Planas et al., 2021b).抗NTD中和抗体はいずれもDelta変異に対して有効ではなかったことから(Figure 1A, 1B),抗RBD中和抗体がDelta変異に対するBNT162b2免疫血清の中和活性に大きな役割を果たしている可能性が高い.

BNT162b2免疫血清のDelta変異に対する抵抗性におけるNTDRBDの寄与を明らかにするために,我々は,NTDRBDまたはS2サブユニットが野生型(W)またはDelta(D)変異のいずれかにコードされたキメラ型スパイクタンパク質を作製した(Figure 3A).抗NTD増強抗体,COV2-2490は,野生型NTDDelta NTDの両方に結合するが,抗NTD中和抗体,4A8は,野生型NTDには結合するが,Delta NTDには結合しない.同様に,抗RBD中和抗体,C144は,野生型RBDDelta RBDの両方に結合するのに対し,抗RBD中和抗体,C002は,野生型RBDには結合するが,Delta RBDには結合しない.予想通り,C002は,野生型RBDを持つスパイク(WWDまたはDWD)にはよく結合したが,Delta RBDを持つスパイク(DDDまたはWDD)には弱く結合した(Figure S2).同様に,抗NTD中和抗体,4A8は,野生型NTDを持つスパイク(WWDまたはWWD)には結合するが,Delta NTDを持つスパイク(DDDまたはDWD)には結合しなかった.また,COV2-2490C144は,すべてのキメラ型スパイクタンパク質に結合した.これらのデータは,キメラ型スパイクタンパク質の各ドメインが本来の抗原性を保持していることを示唆している.

我々は次に,これらの組換えスパイクタンパク質を含む疑似ウイルスを作製し,BNT162b2免疫血清の効果を解析した.WWD疑似ウイルスに対するBNT162b2免疫血清の中和活性は,野生型疑似ウイルス(WWW)と比較してわずかに低下したことから,S2ドメインの変異がDelta変異の耐性に関与していることが示唆された(Figure 3B, 3C).野生型のNTDDelta NTDに置換したDWD疑似ウイルスの感染性をWWD疑似ウイルスと比較すると,BNT162b2免疫血清の中和活性はさらに有意に低下した.DWD疑似ウイルスと比較すると,野生型RBDDelta RBDに置換したWDD疑似ウイルスに対するBNT162b2免疫血清の中和活性が低下した.BNT162b2免疫血清の中和活性は,Delta疑似ウイルス(DDD)に対してさらに低下した.これらのデータは,DeltaスパイクのNTDRBDの両方の変異が,Delta変異に対するBNT162b2免疫血清の耐性に関与していることを示唆している.

Cryo-EM analysis of the Delta spike:

COVID-19患者の抗NTDモノクローナル中和抗体はすべてDeltaスパイクに結合しなかったが,増強抗体の多くはDeltaスパイクとの反応性を維持していた(Figure 1A).DeltaスパイクのNTDにはいくつかの変異があるが,抗NTD中和抗体の既知のエピトープはDelta変異に保存されている.Delta変異における変異が抗NTD中和抗体のエピトープ構造に及ぼす影響を評価するため,単粒子クライオ電子顕微鏡解析(single particle cryo-EM analysis)を行った.データは,heterogenous refinementab-initio再構成(ab-initio reconstruction)に続いて,non-uniform refinementによって解析された.その結果,スパイクタンパク質の密度マップが3.1Åの解像度で得られた(Figure S3, Table S1).スパイクの原子モデルを構築するために,AlphaFold2(Jumper et al., 2021)を用いて,Delta変異NTDの構造を予測した.予測されたDelta変異NTDモデルは,得られたマップにフィッティングするための早期モデル(initial model)として使用された.Delta変異スパイクのモデルの統計値をTable S1にまとめた.Delta変異と野生型スパイクのNTDモデルを比較したところ,増強抗体の主要なエピトープ残基であるH64W66V213R214は構造的によく保存されていた(図4)。一方、抗NTD中和抗体のエピトープの残基では、大きなコンフォメーション変化が見られた(Figure 4).Delta変異と野生型の間の最大原子間距離(maximum interatomic distance)はを超えていた(Figure 4B).Delta変異のNTDでは,4つのエピトープ残基(Y144K147K150W152)を含むβ鎖が,野生型に比べて大幅に短くなり,シフトしていた(Figure 4A).これらの構造変化は,F157R158の欠失によるものと考えられる.その結果,これらの4つの残基は野生型とはかなり異なっていた.R246W258は野生型と比べて大きな変化を示し(Figure 4),これら2つの残基をつなぐループは非常にフレキシブルであるように見えた.これらのデータは,抗NTD中和抗体のエピトープ残基の構造が劇的に変化したことが,Deltaスパイクに対する抗NTD中和抗体の反応性が完全に失われた原因であることを示唆している.

Prediction of possible future mutations of the Delta variant:

Delta変異は,NTDに変異を獲得することで,BNT162b2免疫血清中の抗NTD中和抗体に対して完全な耐性を獲得したことから,BNT162b2免疫血清中の中和活性には主に抗RBD中和抗体が関与していると考えられる(Figure 1, Figure 2, Figure 3).これらの結果から,Delta変異は,抗RBD中和抗体の認識を阻害するRBDの追加変異を獲得することで,BNT162b2免疫血清に対する完全な耐性を獲得する可能性が示唆された.実際,AY.1Delta plus)と呼ばれるRBDK417N変異を獲得したDelta変異が既に出現しており,一般集団におけるその頻度は増加している (Gupta et al., 2021).追加変異の発生の可能性を調べるために,GISAIDデータベースでDelta変異が獲得した変異の相加効果を解析した(Figure S4).Delta変異は,すでにRBDに大量の追加変異を獲得しており,そのうちのいくつかは抗RBD中和抗体のエピトープに生じている(Greaney et al., 2021a; Greaney et al., 2021b; Greaney et al., 2021c; Wang et al., 2021b; Weisblum et al., 2020)K417N変異に加えて,α,β,γおよび/またはLambda変異で観察されるE484KF490またはN501Y変異を有するDelta変異も増加している(Figure 5A).Delta変異の感染者数が急速に増加していることを考えると,Delta変異は感染者の中でさらに変異を獲得し,感染性がさらに高まったものが選択される可能性が高い.実際,GISAIDデータベースによれば,抗RBD中和抗体エピトープに複数の変異を持つDelta変異が既に出現している(Figure 5B).特に,EPI_ISL_2958474は,NTD配列が代表的なDelta変異と同一ではないものの,抗RBD中和抗体エピトープにさらに3つの変異を有している.そこで,SARS-CoV-2変異で観察された主要な変異がDelta変異のRBDに及ぼす影響を解析した(Figure 5C).Delta変異にはT478K変異が含まれており,隣接する残基が同様の効果を示す可能性があるため,S477N変異は除外した.そこで,Deltaスパイク(Delta 4+)にK417NN439KE484KN501Y4つの変異を導入し,これらの変異の影響を解析した(Figure 5D).

Enhanced infectivity of the Delta 4+ pseudovirus by some BNT162b2-immune sera:

我々は,いくつかの抗RBD中和抗体を用いて,RBD1つの追加変異または複数の変異があるDeltaスパイクとの結合を解析した(Figure 6A).ほとんどの抗RBD抗体は,単一の追加変異を持つDeltaスパイクを認識したが,Delta 4+スパイクタンパク質は認識しなかった.R346およびN440を主要なエピトープとするC135RBD中和抗体(Greaney et al., 2021b; Weisblum et al., 2020)は,やはりDelta 4+スパイクを認識した.次に,変異したスパイクタンパク質を持つ疑似ウイルスを作製した.単一のRBD変異を追加したDelta疑似ウイルスは,BNT162b2免疫血清に対してわずかに耐性があった(Figure 6B).追加の単一変異の効果は,最高濃度の血清では感染が完全に阻止されたものの,個体によってわずかに異なっていた.次に我々は,RBD変異を4つ追加したDelta 4+疑似ウイルスを解析した(Figure 6C).驚くべきことに,ほとんどのBNT162b2免疫血清は,相対的に低濃度のBNT162b2免疫血清でDelta 4+疑似ウイルスの感染性を用量依存的に増強したが,最高濃度の血清でのみ弱い中和を示した(Figure6D, 6E).特に,PFZ7は相対的に低濃度の血清で感染性を大きく増強した.PFZ13PFZ14のように,最高濃度の血清でも中和活性を示さない血清もあった.PFZ13およびPFZ14の野生型またはDelta変異に対する中和力価は,他のものより明らかに低かった(Figure 2A).一方,PFZ15Delta 4+疑似ウイルスを効果的に中和したが,野生型およびDelta変異に対するPFZ15の中和力価は他に比べて特に高くなかった.NTDまたはRBDのいずれかに対するほとんどの中和抗体はDelta 4+疑似ウイルスに対して機能しないが,ほとんどの増強抗体はDelta 4+疑似ウイルスに対して機能を維持するため,BNT162b2免疫血清の存在下での感染性の増加は,抗NTD増強抗体によって媒介されていると思われる.

感染性の増強に対するDelta NTDの寄与を解析するために,我々は,野生型NTDDelta 4+ RBDを持つスパイクタンパク質を発現させた疑似ウイルスを作製した(Figure 6C).BNT162b2免疫血清の中には,Delta 4+疑似ウイルスの感染性を高めるものがあるが,野生型NTDを持つDelta 4+ウイルスでは,BNT162b2免疫血清による感染性の増強は見られなかった(Figure 6D, 6E).これらのデータから,Delta変異NTDにおいて変異があると,ウイルスは野生型よりもBNT162b2免疫血清の抗NTD増強抗体の影響を受けやすくなり,その結果,抗RBD中和抗体の中和効果が低下することが示唆された.

Sera from the Delta spike immunized mice do not show enhanced infectivity against Delta 4+ pseudovirus:

BNT162b2 mRNAワクチンには野生型スパイクが使用されたため,一部のBNT162b2免疫血清によるDelta 4+疑似ウイルスの感染性の増強は,Delta 4+疑似ウイルスに対する抗NTDおよび抗RBD中和抗体の中和抗体価が低下したことに起因すると考えられる.したがって,Deltaスパイクで免疫した場合,増強抗体エピトープがDeltaスパイクタンパク質に保存されているにもかかわらず,Delta変異に対する中和抗体価は増強抗体に比べて相対的に高くなる可能性がある.Deltaスパイクによる免疫の効果を調べるために,我々は野生型またはDeltaスパイクタンパク質を一過性にトランスフェクトしたB16F10マウスメラノーマ細胞をマウスに免疫した(Figure 7A).B16F10細胞を使用したのは,B16F10メラノーマ細胞株の免疫原性がかなり低いからである(Priem et al., 2020).また,トランスフェクタントで発現させたスパイクタンパク質のコンフォメーションは,mRNAワクチンで発現させたスパイクタンパク質のコンフォメーションと類似している可能性が高い.すべてのマウスはスパイクタンパク質に対する抗体を効果的に産生した(Figure S5).野生型スパイクを免疫した血清は,野生型疑似ウイルスをよく中和したが,Delta疑似ウイルスに対する中和効果はBNT162b2免疫血清と同様に低下した(Figure 7B, 7C).一方,Deltaスパイクを免疫した血清は,野生型およびDelta疑似ウイルスをよく中和した.わずか1匹のマウスが,野生型疑似ウイルスよりもDelta疑似ウイルスを中和する抗体を産生した.Delta-4+疑似ウイルスを解析したところ,野生型スパイク免疫マウスの一部の血清は,BNT162b2免疫血清の一部と同様に,相対的に低濃度の血清で用量依存的に感染性の増強を示した(Figure 7D, 7E).特に#w1マウス血清は,どの濃度でも感染性の増強を示したが,同じ血清は野生型疑似ウイルスをよく中和した.一方,Deltaスパイクを免疫に用いた場合には,免疫血清による感染性の増強は認められなかった.Deltaスパイクを免疫したマウスの血清は,どの濃度の血清でも感染性の増強を示さなかった.これらのデータは,将来出現する可能性のあるDelta亜変異を制御するためには,野生型ではなくDeltaスパイクを含むワクチンが必要である可能性を示唆している.

Discussion

Delta変異は感染性が強く,完全ワクチン接種した人へのブレイクスルー感染がしばしば観察される(Lopez Bernal et al., 2021).このことから,完全ワクチン接種した人の中和抗体は,Delta変異を防御するのに十分ではないと考えられる.抗RBD抗体は,SARS-CoV-2感染防御に大きな役割を果たしていると考えられる.Delta変異は,RBDL452RおよびT478K変異を有しており,L452は一部の中和抗体のエピトープであることが示されている(McCallum et al., 2021; Wang et al., 2021b).しかし,ほとんどの中和抗体はDelta RBDに結合し,感染を中和した.したがって,RBD変異だけでは,Delta変異に対するBNT162b2免疫血清の中和力価の低下を説明できない可能性がある

Delta変異は,NTDに複数の変異(T19RG142DE156GF157delR158del)を持つすべての抗NTD中和抗体がDeltaスパイクを認識できなかったことから,Delta変異ウイルスは,広く使用されているmRNAワクチンの抗原成分である野生型スパイクタンパク質によって惹起される抗NTD中和抗体に対して完全に抵抗性であることが示された.一方,ほとんどの抗NTD増強抗体は,Deltaスパイクを野生型スパイクと同じレベルで認識し,一部の抗NTD増強抗体は,野生型疑似ウイルスと比較して,Delta疑似ウイルスによる感染性増強を示すことがわかった.この観察結果と一致するように,増強抗NTD抗体エピトープの構造は,野生型でよく保存されていた.増強抗体は,抗RBD中和抗体の中和活性を低下させることから(Li et al.2021; Liu et al.2021b),NTDの変異は,Delta変異のBNT162b2免疫血清に対する耐性に重要な役割を果たしている可能性がある.実際,野生型NTDを有するDelta疑似ウイルスは,完全Delta疑似ウイルスよりもBNT162b2免疫血清による中和を受けやすかった.Delta NTDの影響は,Delta 4+疑似ウイルスでより明らかであった.これらのデータは,NTDの変異がSARS-CoV-2の中和抗体からの逃避に関与していることを示している.中和抗体の結合を無効にし,増強抗体の結合を維持するNTDの変異は,ウイルスにとって有益であると考えられるDelta変異のこれらの変異は,ワクチン接種を受けた宿主や過去に感染した宿主において,抗NTDおよび抗RBD中和抗体からの逃避を維持しつつ,増強抗体の存在に適応していることを示唆しているのかもしれない(adaptation to the presence of enhancing antibodies while maintaining evasion of anti-NTD and anti-RBD neutralizing antibodies in immunized or previously infected hosts

Deltaだけでなく,Alpha(B.1.1.7)Beta(B.1.135)Gamma(P.1)などの他のVOCsでも,RBDよりもNTDに多くの変異が見られる.NTDは,RBDのコンフォメーションの調節には関与しているが,宿主受容体であるACE2との直接的な結合には関与していないため(Liu et al., 2021b),多くの変異を許容することができるDelta変異と同様に,ほとんどの抗NTD中和抗体は,AlphaおよびBeta変異には結合しないことが報告されている(Voss et al., 2021; Wang et al., 2021a).最近では,L-SIGNSARS-CoV-2のエントリー受容体であることが報告されている(Amraei et al., 2021; Kondo et al., 2021; Soh et al., 2020; Thepaut et al., 2021)L-SIGNは,SARS-CoV-2スパイクタンパク質のRBDではなくNTDに特異的に結合し,膜融合を誘導することで非ACE2発現細胞のSARS-CoV-2感染を媒介した(Soh et al., 2020).さらに,抗NTD中和抗体は,L-SIGN発現細胞へのSARS-CoV-2感染を,ACE2発現細胞への感染に比べて効率的に阻止した.in vitroでは抗RBD中和抗体に比べて中和効率がかなり低いにもかかわらず、ほとんどのVOCsが抗NTD中和抗体から完全に逃避していることを考えると,L-SIGNやその他の未知の受容体を介したNTDによって媒介されるSARSCoV-2感染は,in vitroよりもin vivoでより重要な役割を果たしているのかもしれないSARS-CoV-2の病原性を解明するためには,NTDの機能や抗NTD中和抗体のさらなる解析が必要である.

増強抗体は,NTD上の特定の部位に結合し,RBDのオープンフォームを誘導することで,スパイクタンパク質のACE2に対する親和性を高める(Liu et al., 2021b).最近では,増強抗体はin vivoでの感染性を高めないことが報告されている(Li et al., 2021).しかし既知の11のエンハンサー抗体のうち,1つのヒトIgG1モノクローナル増強抗体のみが,in vivoで試験されている.NTDに対する増強抗体の親和性やエピトープ,さらには増強抗体のIgGサブクラスが,in vivoにおける機能に影響を与えている可能性がある.近年,中和抗体がin vivoで中和活性をもつために,Fc受容体への結合が必要であることが報告されている(Schafer et al., 2021; Suryadevara et al., 2021; Winkler et al., 2021).実際,in vivo研究で最も頻繁に使用される抗体サブクラスであるIgG1は,Fc受容体への親和性が最も強く,強い増強機能を示す; 一方,IgG2およびIgG4Fc受容体に弱く結合する(Nimmerjahn and Ravetch, 2008).したがって,in vivoにおける抗NTD増強抗体の機能は抗体サブクラス,特定の可変領域配列,あるいはその両方によって異なると考えられる.Delta変異では増強抗体のエピトープが維持されており,増強抗体に対する感受性も高いことから,in vivoにおいて増強抗体がSARS-CoV-2の感染性増強に関与している可能性が高い

いくつかのBNT162b2免疫血清は,1:10希釈でDelta 4+疑似ウイルスに対する中和活性を示したが,1:30希釈では逆に感染性が増加した.一般に中和抗体の活性は,3倍の濃度差があってもそれほど急激には変化しない.したがって,Delta 4+疑似ウイルスに対するBNT162b2免疫血清の効果は,単に中和抗体の濃度では説明できないBNT162b2免疫血清は,どの血清濃度においても,野生型NTDを含むDelta 4+疑似ウイルスに対する感染性の増強を示さなかった.抗NTD感染性増強モノクローナル抗体の効果は,抗RBD中和抗体の濃度に影響されるため(Li et al., 2021; Liu et al., 2021b)BNT162b2免疫血清の感染性増強抗体の効果は,抗RBD中和抗体の濃度がある閾値以下になると,より顕著になると考えられる.実際,Delta疑似ウイルスに対する中和抗体価が低いBNT162b2免疫血清は,血清濃度が高くてもDelta 4+疑似ウイルスに対する感染性増強効果を示した.中和抗体価は,2回目の免疫から3週間後に最も高くなるものの,徐々に低下していく(Doria-Rose et al., 2021; Widge et al., 2021)希釈血清の場合と同様に,中和抗体価と増強抗体価が同じように減少しても,免疫後しばらくしてから感染性増強抗体の効果がより明らかになる可能性がある.また,アデノウイルスワクチンや不活化ワクチンで誘導される中和抗体価は,mRNAワクチンで誘導される中和抗体価よりも低い(Lim et al., 2021; Shrotri et al., 2021)したがって,中和力価の低いBNT162b2免疫血清と同様に,アデノウイルスワクチンや不活化ワクチンの免疫血清では,Delta 4+疑似ウイルスに対する増強効果がより顕著になる可能性があると考えられる.一方,BNT162b2免疫血清の中には,どの血清濃度でもDelta 4+疑似ウイルスの感染を増強せず,よく中和する(neutralized well)ものがあった.同様に,近交系マウス(inbred mice)を使用したにもかかわらず,Delta 4+疑似ウイルスの感染性に対する血清の影響は,野生型スパイクで免疫したマウスの個体間で大きく異なっていた.あるマウスの血清はDelta 4+ 疑似ウイルスの感染を増強したが,他のマウスはどの血清濃度でも中和を示した.中和抗体と増強抗体の抗体価,親和性,エピトープの微妙なバランスが,血清の感染性への影響に影響しているのかもしれない.免疫後に産生される中和抗体と増強抗体の特徴をさらに解析することが重要である.

SARS-CoV-2はこれまでに数多くの変異を獲得してきたが,それらは感染者の中で生じたものである.そのため,多くの人が感染している状況では,新しい変異ウイルスがより頻繁に出現すると考えられる.Delta変異は爆発的に広がっているため,スパイクタンパク質のコード領域ではすでに多数の追加変異を獲得しており,Delta変異は今後もさらなる変異を獲得していくことが示唆される.Delta変異のRBDで観察されたいくつかの変異は,抗RBD中和抗体のエピトープであることが報告されている(Greaney et al., 2021a; Greaney et al., 2021b; Wang et al., 2021b).宿主の免疫系の環境に適応した新しく出現した変異ウイルスが選択され,拡大していく.RBD4つの追加変異があるDelta変異は,NTDに唯一の変異(unique mutations)があるため,ほとんどのBNT162b2免疫血清で中和されなかったさらに重要なことは,Delta 4+の感染性は,一部のBNT162b2免疫血清によって増強されたことである.さらに,追加された4つの変異のうち,3つの変異を持つDelta変異がすでにGISAIDデータベースに登録されており,RBDで合計5つの変異を獲得したDelta変異ウイルスは,近い将来,追加の変異を獲得する可能性が高いと考えられる.今回,Delta変異の追加変異として,K417NN439KE484KN501Yを選択したが,他の抗RBD中和エピトープの組み合わせでも,Delta 4+変異ウイルスと同等またはそれ以上の効果が予想される.実際,Delta 4+は,C135などの抗RBD中和抗体の主要なエピトープ残基の一つであるR346を有している.現在のSARS-CoV-2の高い変異率を考えると,新たに出現するスパイク変異を予測することは,新たに出現するSARS-CoV-2の変異ウイルスに対する効果的なワクチンを開発する上で非常に重要である.将来出現する可能性のある危険な変異ウイルスのスパイクタンパク質による免疫は,そのような変異ウイルスの出現を防ぐために有効であると考えられる.

現在,SARS-CoV-2ワクチンによる3回目のブースター免疫を検討中である.我々のデータは,野生型スパイクを繰り返し免疫することは,新たに出現したDelta変異を制御するのに有効ではない可能性を示唆している我々は,Deltaスパイクによる免疫は,感染性を高めることなく,Delta変異だけでなく,野生型やDelta 4+変異ウイルスも中和する抗体を誘導することを示したmRNAワクチンは,今回の動物モデルとは異なる結果が得られる可能性があるが,Deltaスパイクを発現するmRNAワクチンの開発は,新たに出現するDelta変異の制御に有効であると考えられる.しかし,中和抗体ではなく増強抗体のエピトープは,Delta変異を含むほとんどのSARS-CoV-2変異ウイルスでよく保存されている.そのため,野生型のSARS-CoV-2に感染したことがある人や,野生型のスパイクタンパクからなるワクチンで免疫したことがある人では,SARS-CoV-2変異ウイルス由来のスパイクタンパクを追加で免疫することで,中和抗体よりも増強抗体が高まる可能性がある.抗NTD増強抗体を誘導しないRBDのみを用いた免疫は,ワクチンの戦略となりうる.しかし,抗RBD中和抗体と同様にSARS-CoV-2感染を防御する抗NTD中和抗体は,RBD単独による免疫では誘導されない(Chi et al., 2020; Li et al., 2021 ; Liu et al., 2020; Suryadevara et al., 2021; Voss et al., 2021). メジャー変異ウイルスで観察されたRBD変異を含むが,増強抗体エピトープを欠く全スパイクタンパク質(whole spike protein)は,ブースターワクチンとして検討する必要があるかもしれない

 

Figure1Neutralizing and enhancing effects against the wild-type and Delta spike pseudovirus by anti-spike monoclonal antibodies from COVID-19-patients.

(A) The HEK293 cells transfected with the wild-type or the Delta spike were stained with antiNTD enhancing antibodies (red), anti-NTD neutralizing antibodies (green), anti-NTD nonenhancing, non-neutralizing antibodies (black), anti-RBD neutralizing antibodies (blue) and antiS2 antibodies (gray) (1 μg/ml). The stained cells were analyzed by flow cytometer. The relative mean fluorescence intensities (MFI) of antibodies binding to the Delta spike were compared with that for the wild-type spike. (B-D) The ACE2-expressing HEK293 cells were infected with the wild-type (upper) or the Delta (lower) pseudovirus in the presence of the anti-NTD neutralizing antibodies (B), anti-RBD neutralizing antibodies (C) and anti-NTD enhancing antibodies (D). A negative value for % neutralization indicates enhanced infectivity. The data from quadruplicates are presented as mean ± SEM. The representative data from three independent experiments are shown. See also Figure S1.

 

Figure 2: Neutralizing activity of BNT162b2-immune sera against the wild-type and the Delta pseudovirus.

(A) Neutralizing activity of twenty BNT162b2-immune sera against the wild-type (green) and the Delta (red) pseudovirus. Data are mean ± SEM of technical quadruplicates. (B) PRNT50 titers of the BNT162b2-immune sera against the wild-type (green) and the Delta (red) pseudovirus are shown. p values determined by paired t-test were indicated. The representative data from three independent experiments are shown. See also Figure S1.

 

 

Figure 3: Neutralizing activity of BNT162b2-immune sera against the pseudovirus with chimeric spike protein of the wild-type and Delta variants.

(A) The chimeric spike proteins between the wild-type (W) and Delta variant (D). Mutations of the Delta spike are indicated. (B) Neutralizing activity of BNT162b2-immune sera against the pseudoviruses with chimeric spike proteins. The data from quadruplicates are presented as mean ± SEM. (C) PRNT50 titers of BNT162b2-immune sera against the pseudoviruses with chimeric spike proteins. p values determined by paired t-test were indicated. The representative data from 2 independent experiments are shown. See also Figure S1 and S2.

 

Figure 4: Cryo-EM analysis of the Delta NTD.

(A) Structure of the Delta NTD (light blue) analyzed by the Cryo-EM were superimposed with the wild-type NTD (light brown, PDB: 7LY3). Major anti-NTD enhancing antibody epitopes (blue) and anti-NTD neutralizing antibody epitopes (red) were indicated in the figure. (B) Cα displacement between the wild-type and the Delta NTD was shown. The value was calculated by UCSF chimera. All known anti-NTD enhancing antibody epitopes (blue) and antiNTD neutralizing antibody epitopes (red) were indicated. The regions where structures of wildtype or Delta NTD were not determined (magenta), and mutations in the Delta NTD (green) are indicated on the axis. See also Figure S3 and Table S1.

 

 

Figure 5: Possible mutations that may be acquired by the Delta variant.

(A) Number of the Delta variants with additional mutations at the RBD registered in the GISAID database in each month from January, 2021 to July, 2021. The data registered at July are not enough and will be increased later. (B) The Delta variants with additional mutations at multiple epitopes of the anti-RBD neutralizing antibodies. L452R and T478K mutations are observed in all the Delta variants (purple). Anti-RBD neutralizing antibody epitopes introduced into the Delta 4+ (blue), and anti-RBD neutralizing antibody epitopes observed in the natural Delta variants but not introduced into the Delta 4+ (green) are shown with the respective GISAID accession number. (C) Number of the major RBD mutations acquired by all SARS-CoV-2 variants. L452R and T478 are mutations observed for the representative Delta variant (blue). N501Y, N439K, E484K and K417N were selected to generate the Delta 4+ variant (red). (D) Location of additional mutations introduced into the Delta RBD. Structures of the RBD of the wild-type (light brown) and the Delta variant (light blue) predicted by AlphaFold2 were superimposed. Mutations of the Delta variant (purple), anti-RBD neutralizing antibody epitopes to generate the Delta 4+ (blue), and anti-RBD neutralizing antibody epitopes observed in the natural Delta variants but not introduced into the Delta 4+ (shown in C; green) are indicated in the figure. See also Figure S4.

 

 

Figure 6: Enhanced infectivity of the Delta 4+ pseudovirus by the BNT162b2-immune sera.

(A) Anti-RBD antibody binding to the Delta spike with additional mutations at the RBD. AntiRBD mAb binding (1 μg/ml) to the mutant spike was compared to that of the wild-type spike. The Delta 4+ spike contains additional mutations of K417N, N439K, E484K and N501Y. (B) Neutralizing activity of BNT162b2-immune sera against the Delta pseudoviruses with a single additional mutation at the RBD as indicated in the figure. The data from quadruplicates are presented as mean ± SEM. (C) The construct of the Delta 4+ and Delta 4+ with wild-type (WT) NTD. Mutations in the original Delta variant (black) and the four mutations added to the Delta RBD (red) were shown. (D) Neutralizing activity of BNT162b2-immune sera against the pseudovirus with Delta 4+ spike (red) and Delta 4+ spike with wild-type NTD (green). (E) Neutralizing activity of 31.6 times diluted BNT162b2-immune sera. p value determined by paired t-test were indicated. Negative values for % neutralization indicates enhanced infectivity (B, D, E). The data from quadruplicates are presented as mean ± SEM. The representative data from three independent experiments are shown.

 

Figure 7: Sera from delta spike-immunized mice do not show enhanced infectivity.

(A) Freeze and thawed wild-type and Delta spike-B16 transfectants were immunized to the mice with complete Freund's adjuvant (CFA). (B) Neutralizing activity against the wild-type (green) or Delta (red) pseudovirus (PV) by sera from the wild-type spike (upper column) or Delta spike (lower column) spike-immunized mice. (C) Neutralizing activity against the wild-type and Delta pseudovirus by 31.6 times-diluted sera from wild-type (light blue line) or Delta (orange line) spike-immunized mice. (D) Neutralizing activity against the Delta 4+ pseudovirus by sera from the wild-type spike (upper column, blue) or Delta spike (lower column, red) immunized mice. (E) Neutralizing activity against the Delta 4+ pseudovirus by the 31.6 times-diluted sera from the wild-type spike (blue) or Delta spike (red) immunized mice. n.s.: not statistical significance, p value was determined by t-test. A negative values for % neutralization indicates enhanced infectivity. All data from quadruplicates are presented as mean ± SEM. See also Figure S1 and S5.

2021.08.22.457114v1.full.pdf