COVID-19関連追加(2021929-2

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202191日(Delta変異ウイルスの病原性と伝播動態)

202198日(VOCsの臨床的およびウイルス学的特徴(重症度,感染性の推定))

 

B.1.617.2は肺細胞への侵入と融合の効率を高め,

感染やワクチン接種によって誘発される抗体を逃避する】

Arora P, et al. B.1.617.2 enters and fuses lung cells with increased efficiency and evades antibodies induced by infection and vaccination. Cell Reports. Sep 27, 2021.

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109825.

Highlights

B.1.617.2スパイクの媒介によって,Calu-3およびCaco-2細胞への侵入が促進される.

B.1.617.2スパイクは,野生型スパイクよりも効率的に細胞を融合する(細胞間融合[cell-to-cell fusion]).

B.1.617.2スパイクはバムラニビマブ耐性である.

B.1.617.2スパイクは,感染やワクチン接種によって誘発される中和抗体を逃避する.

Summary

SARS-CoV-2デルタ変異,B.1.617.2は,インドで出現し,80ヶ国を超えて広がっている.英国ではB.1.617.2B.1.1.7に代わって優勢のウイルスとなり,新規感染者が急増しており,他の国でも同様の展開が予想される.効果的な対策を講じるためには,ワクチン誘発性抗体やCOVID-19治療として使われる抗体による制御に対するB.1.617.2の感受性に関する情報が必要である.我々は,B.1.617.2B.1.351と比較して,その程度は低いものの,感染やBNT162b2ワクチン接種によって誘発される抗体による制御を逃避することを,pseudotypingを用いて示した.また,B.1.617.2は,COVID-19治療のために緊急使用が認められているモノクローナル抗体であるバムラニビマブに対しても耐性があることがわかった.最後に我々は,B.1.617.2は,Calu-3肺細胞への侵入が促進され,細胞間融合(cell-to-cell fusion)が増強されており,これがこの変異の伝播性と病原性の増大(augmented)に寄与している可能性があることを示す.これらの結果から,B.1.617.2は,肺細胞への侵入と融合の能力が高まった免疫逃避変異であることが明らかになった.

 

 

Graphical Abstract

 

Main

Introduction

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2SARS-CoV-2)の不活化全ウイルスワクチン,アデノウイルスベクターワクチン,またはmRNAスパイク(S)タンパク質をエンコードするmRNAワクチンは,COVID-19を防御し,COVID-19パンデミックに効果的に対抗することができる(Golob et al., 2021; Polack et al., 2020; Xia et al., 2021).これらのワクチンの主な特徴は,ワクチン接種者に中和抗体産生を誘導する能力があることである.これらの抗体は,ウイルスの細胞への侵入を促進するSタンパク質の能力に干渉し,異なる作用様式を示すことができる.例えば,受容体結合ドメイン(RBD)を標的とした抗体は,Sタンパク質が細胞性受容体(cellular receptor)であるアンジオテンシン変換酵素2ACE2)と結合するのを直接阻害することができる(Barnes et al., 2020).さらに,RBD以外のエピトープ,主にS1サブユニットのN末端ドメイン内に向けられた抗体は,Sタンパク質のACE2への結合を立体的に遮断する,あるいはRBDACE2と相互作用しないコンフォメーション状態でSタンパク質をロック(lock)する,あるいは融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへのSタンパクの移行を無効する可能性がある(Chi et al., 2020; Liu et al., 2020; Suryadevara et al., 2021)

現在のワクチンは,パンデミック初期に流行したウイルスのSタンパク質を免疫系の抗原として提示する.しかし,パンデミック後期になると,SARS-CoV-2  VOCsが出現した.この変異ウイルスは,Sタンパク質に伝播性の増強(B.1.1.7, Alpha変異)および/または免疫逃避(B.1.351, Beta変異, P.1, Gamma)を可能にする変異を有している(Plante et al., 2021b).伝播性を高める変異は,細胞性受容体であるACE2との結合を強める可能性があり,免疫逃避をもたらす変異は,中和抗体のエピトープを変化させる可能性がある(Plante et al., 2021b).免疫逃避により,回復期者やワクチン接種者への感染が可能になるが,ベクターワクチンやmRNAワクチンは,AlphaBetaGammaといったVOCによって誘発される重症COVID-19に対して防御する.

20214月から5月にかけて,インドでCOVID-19症例の大規模な急増を認めたが,これは新しい変異B.1.617の拡散と関連しており,その後B.1.617.1(またはKappa変異),B.1.617.2(またはDelta変異),B.1.617.3変異へと分岐した.その後,B.1.617.2変異は80ヶ国を超えて広まり,インドと英国で優勢になった(Campbell et al.2021; Singh et al.2021).英国では,B.1.617.2の拡散に伴い,症例が著しく増加し,現在では80%を超える新規感染者がB.1.617.2によるものとなっている.B.1.617.2の拡散は,ドイツ,米国をはじめとするいくつかの国でも急速に増加することが予想されており,最近ではポルトガルのリスボンで渡航制限が必要なほど患者が大量に発生したこともB.1.617.2によるものと考えられている.現在,VOCとみなされているB.1.617.2の拡大を抑制するためには,回復期の患者やワクチン接種を受けた患者がこの変異ウイルスによる感染から防御されるかどうかを明らかにすることが重要である.ここでは,抗体によるSARS-CoV-2の中和を研究するのに適したツールである,reporter   particles pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike (S) proteinを用いて(Riepler et al., 2020; Schmidt et al., 2020),この疑問に取り組んだ.

 

 

Results

B.1.617.2Sタンパク質は,Wuhan-1分離株(EPI_ISL_406798)のSタンパク質と比較して,Sタンパク質の表面単位(surface unit)であるS19つ,膜貫通単位(transmembrane)であるS21つの変異があることがわかった(Figure 1A-B).変異T19RG142DE156GF157ΔR158Δは,中和抗体のエピトープを含むS1N末端ドメインに位置している(Chi et al., 2020; Liu et al., 2020; McCallum et al., 2021; Suryadevara et al., 2021)RBDには,変異L452RT478Kが存在する変異L452Rは抗体媒介性の中和を低下させ(Deng et al., 2021; Liu et al., 2021b)T478Kは感染性を高める可能性が推測されている(Wang et al., 2021)変異D614Gは,RBDS1/S2開裂部位の間に位置し,ACE2結合の増加,上気道における複製そして伝播性に関連している(Figure 1A-B(Plante et al., 2021a; Zhou et al., 2021).最後に,P681RS1/S2部位でのSタンパク質の開裂を増加させる可能性があるが,Sタンパク質主導の侵入と抗体によるその阻害にD950Nが与える影響は不明である

我々はまず,B.1.617.2 Sタンパク質が,SARS-CoV-2研究でよく用いられるcell lineである,Vero(アフリカミドリザル,腎臓),293T(ヒト,腎臓),Caco-2(ヒト,大腸)Calu-3(ヒト,肺)への強固な侵入を媒介するかどうかを調べた.いずれのcell lineも内因性ACE2を発現しており,VeroCaco-2Calu-3の各細胞は,authentic SARS-CoV-2を用いた感染研究によく用いられる.B.1.617.2 Sタンパク質は,293T細胞およびVero細胞への侵入をWT Sタンパク質と同等の効率で媒介したが,Caco-2細胞への侵入(約1.5倍)およびCalu-3細胞への侵入(約2.0倍)は増強されたFigure 1C and Supplemental Figure 1ASARS-CoV-2の標的は肺であるが,大腸への感染も報告されており,B.1.617.2がこれらの組織の標的細胞への侵入能力を高めている可能性を示唆する最後に我々は,B.1.617.2 Sタンパク質のACE2結合の増加を検出しなかったことから(Figure 1D),Caco-2およびCalu-3細胞への侵入が増加したのは,ACE2結合の増加によるものではないことが示唆された

 

 

Sタンパク質は,ウイルス膜と細胞膜の融合を促進する能力に加えて,さらに隣接する細胞の融合を促進することが可能であり,その結果,合胞体(syncytiaと呼ばれる多核巨細胞のフォーメーションが形成される.この合胞体は,directed S protin expressionあるいはSARS-CoV-2感染後のin vitroで観察され,COVID-19患者の死後組織でも観察されている(Bussani et al., 2020; Tian et al., 2020; Xu et al., 2020)SARS-CoV-2 Sタンパク質が駆動する合胞体形成がCOVID-19の病態に寄与していると考えられることから,我々は,高レベルのACE2を発現するように設計されたヒト肺cell line A549において,B.1.617.2 Sタンパク質が細胞間融合(cell-to-cell fusionを駆動する能力を調べた.予想通り,WT Sdirected expressionによって合胞体形成が生じたが,empty expression plasmidをトランスフェクトした細胞は正常なままであった(Figure 1E).驚くべきことに,B.1.617.2 Sタンパク質のdirected expressionは,より多くの大きな合胞体が生じ,そして細胞間融合(cell-to-cell fusion)を定量化すると,B.1.617.2 Sタンパク質による融合は,WT Sに比べて約2.5倍の効率性があることがわかった(Figure 1E

我々は次に,B.1.617.2の侵入が,COVID-19治療のための緊急使用許可を得た組換え抗体(recombinant antibodies)による阻害を受けやすいかどうかを調べた(Supplemental figure 1B).検査した抗体4つのうち3つは,WT Sタンパク質と同等の効率でB.1.617.2 Sタンパク質を阻害した(Figure 1F and Supplemental Figure 1C).しかし,B.1.617.2はバムラニビマブに抵抗性を示したが,これは変異L452Rが原因である可能性が高い(Supplemental Figure 1B(Starr et al., 2021).したがって,バムラニビマブ単剤療法は,B.1.617.2感染の予防や治療には適していないと考えられる.最後に我々は,B.1.617.2の侵入が,感染者あるいはワクチン接種者が生成した抗体によって阻害されるかどうかを調べた.この実験では,VOC B.1351が中和抗体から著しく逃避することから,B.1.351 Sタンパク質を対照とした.ドイツのUniversity Hospital Göttingenで採取されたCOVID-19回復期患者の血漿(Hoffmann et al., 2021a) は,WT Sタンパク質と比較すると,わずかに効率を落としてB.1.617.2 Sタンパク質による侵入を中和した(Figure 1G and Supplemental Figure 1D.対照的に,B.1.351 Sタンパク質に依存した侵入の中和は著しく低下した.最後に,BNT162b22回投与されたドナーからの以前に特徴づけられた血清(Hoffmann et al., 2021b)を用いても同様の観察がなされたが,B.1.617.2の免疫逃避は回復期血清と比較して,より顕著であった(Figure 1H and Supplemental Figure 1E

 

 

Figure 1: The spike protein of SARS-CoV-2 B.1.617.2 promotes efficient entry into human   lung and colon cells, causes more cell-to-cell fusion and evades antibody-mediated   neutralization.  

(A) Schematic overview of the S protein from SARS-CoV-2 variant B.1.617.2 (RBD, receptor binding domain; TD, transmembrane domain). 

(B) Location of the mutations found in SARS-CoV-2 variant B.1.617.2 in the context of the   trimeric spike protein (Color code: light blue, S1 subunit with RBD in dark blue; gray, S2   subunit; orange, S1/S2 and S2’ cleavage sites; red, mutated amino acid residues). 

(C) Pseudotyped particles bearing the S protein of wildtype (WT) SARS-CoV-2 or variant   B.1.617.2 were inoculated onto the indicated cell lines and transduction efficiency was quantified  by measuring virus-encoded luciferase activity in cell lysates at 16-18 h post transduction.   Presented are the average (mean) data from six biological replicates (each conducted with   technical quadruplicates) for which transduction was normalized against SARS-CoV-2 S WT (=   1). Error bars indicate the standard error of the mean (SEM). Statistical significance of   differences between WT and B.1.617.2 S proteins was analyzed by two-tailed Students t-test (p >   0.05, not significant [ns]; p ≤ 0.01, **). See also Figure S1A. 

(D) BHK-21 expressing the S protein of WT SARS-CoV-2 or variant B.1.617.2 were   subsequently incubated with soluble ACE2 (harboring a C-terminal Fc-tag derived from human   IgG) and AlexaFluor-488-conjugated anti-human antibody, before being subjected to flow   cytometry. ACE2 binding efficiency was analyzed by measuring the geometric mean channel   fluorescence at 488 nm. Untransfected cells and cells transfected with empty expression plasmid   served as controls. Presented are the average (mean) data from six biological replicates (each conducted with single samples). Error bars indicate the standard deviation (SD). Statistical   significance of differences between WT and variant B.1.617.2 S proteins was analyzed by two tailed Students t-test (p > 0.05, ns). 

(E) Analysis of S protein induced cell-to-cell fusion. A549-ACE2 cells were transfected with   expression plasmid for the indicated S proteins or empty vector (EV). At 24 h posttransfection,   cells were fixed and subsequently stained with May-Gruenwald and Giemsa solutions.   Presented are representative microscopic images (scale bar = 200 µm). For quantification of   fusion efficiency, the total number of nuclei in syncytia per image was counted. Presented are the   average (mean) data from four biological replicates (each conducted with single samples; for   each sample, three randomly selected areas were imaged and independently analyzed by two   persons). Error bars indicate the SEM. Statistical significance of differences between WT and   B.1.617.2 S proteins was analyzed by two-tailed Students t-test (p ≤ 0.001, ***). 

(F) Neutralization of SARS-CoV-2 WT, B.1.351 and B.1.617.2 S proteins by monoclonal   antibodies used for COVID-19 therapy. Pseudotyped particles bearing the S protein of WT   SARS-CoV-2 or variant B.1.617.2 were incubated for 30 min at 37 °C in the presence of   escalating concentrations (0.00002, 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2, 2 µg/ml) of the indicated SARS-CoV-2 S protein-specific monoclonal antibody (please see Figure S1B) or an unrelated control   antibody (please see Figure S1C), before being inoculated onto Vero cells. Transduction   efficiency was quantified by measuring virus-encoded luciferase activity in cell lysates at 16-18 h   post transduction. Presented are the average (mean) data from a single biological replicate   (conducted with technical quadruplicates) for which transduction was normalized against samples   that did not contain any antibody (= 0% inhibition). Error bars indicate the SD. The results were   confirmed in a separate experiment.

(G) Neutralization of SARS-CoV-2 WT, B.1.351 and B.1.617.2 S proteins by antibodies in   convalescent plasma. Pseudotyped particles bearing the S protein of WT SARS-CoV-2 or variant   B.1.617.2 were incubated for 30 min at 37 °C in the presence of different dilutions of   convalescent plasma (1:25, 1:100, 1:400, 1:1,600, 1:6,400, 1:25,600). Transduction efficiency   was quantified by measuring virus-encoded luciferase activity in cell lysates at 16-18 h post transduction and used to calculate the plasma dilution factor that leads to 50 % reduction in S   protein-driven cell entry (neutralizing titer 50, NT50). Presented are the data from a single   biological replicate (conducted with technical quadruplicates) for a total of eight convalescent   plasma (black lines indicate the median, error bars indicate the SEM). Statistical significance of   differences between the indicated groups was analyzed by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's   post-hoc test (p > 0.05, ns; p ≤ 0.05, *; p ≤ 0.01, **; p ≤ 0.001, ***). Please see also Figure S1D. 

(H) The experiment was performed as described for panel G but this time serum from   Comirnaty/BNT162b2-vaccinated individuals was investigated. Presented are the data from a   single biological replicate (conducted with technical quadruplicates) for a total of fifteen vaccinee   sera (black lines indicate the median, error bars indicate the SEM). Please see also Figure S1E.

 

 

 

 

Figure S1: Cell entry and evasion of antibody-mediated neutralization by the spike protein of SARS-CoV-2 B.1.617.2 (related to Figure 1).

(A) Transduction data normalized against the assay background (related to Figure 1C). The experiment was  performed as described in the legend of Figure 1C. Presented are the average (mean) data from the same six  biological replicates (each conducted with technical quadruplicates) as presented in Figure 1C with the difference  that transduction was normalized against signals obtained from cells inoculated with particles bearing no viral  glycoprotein (background, set as 1). In addition, transduction data of particles bearing VSV-G are included. Error  bars indicate the SEM.

(B) Location of the receptor binding domain (grey) mutations L452R and T478K (both red) of SARS-CoV-2 variant  B.1.617.2 in the context of the interfaces for ACE2 binding (orange) and binding of monoclonal antibodies used for COVID-19 therapy.

(C) An unrelated control antibody does not affect cell entry of particles pseudotyped with SARS-CoV-2 WT,  B.1.351 or B.1.617.2 S (related to Figure 1E). The experiment was performed as described in the legend of Figure  1F.

(D) Individual neutralization data for convalescent plasma (related to Figure 1G). Particles pseudotyped with the  indicated S proteins were incubated (30 min, 37 °C) with different dilutions of convalescent plasma before being  inoculated onto Vero cells. Transduction efficiency was quantified by measuring virus-encoded luciferase activity in  cell lysates at 16-18 h posttransduction. Presented are the data from a single representative experiment conducted  with technical quadruplicates. For normalization, inhibition of S protein-driven entry in the absence of plasma was  set as 0%. Error bars indicate the SD. The data were further used to calculate the plasma dilution that leads to 50%  reduction in S protein-driven cell entry (neutralizing titer 50, NT50; shown in Figure 1G).

(E) Individual neutralization data for vaccinee serum (related to Figure 1H). Particles pseudotyped with the indicated  S proteins were incubated (30 min, 37 °C) with different dilutions of serum from individuals vaccinated with the  Pfizer/BioNTech vaccine Comirnaty/BNT162b2 before being inoculated onto Vero cells. Transduction efficiency  was quantified by measuring virus-encoded luciferase activity in cell lysates at 16-18 h posttransduction. Presented  are the data from a single representative experiment conducted with technical quadruplicates. For normalization,  inhibition of S protein-driven entry in the absence of serum was set as 0%. Error bars indicate the SD. The data were  further used to calculate the NT50 (shown in Figure 1H).

 

 

 

 

Discussion

我々の結果は,B.1.617.2による免疫逃避結腸および肺細胞への侵入増強合胞体形成の増大を示す.B.1.617.2による抗体媒介性中和の逃避は,最近の2つの研究(Liu et al., 2021a; Wall et al., 2021)と一致しており,B.1.1.7で我々が以前に観察したものよりも顕著であるが,B.1.351と比較すると(Hoffmann et al., 2021a),明らかに少ない.この知見は,B.1.617.2のワクチンブレイクスルーが増加したことと互換性があるものの,BNT162b2が依然としてB.1.617.2によるCOVID-19を防御することを示唆している.バムラニビマブ単独での治療は効果的ではないが,我々のデータによると,カシリビマブ,イムデビマブ,エテセビマブはB.1.617.2感染者に対して,特に感染後早期に投与した場合,有効な治療オプションであり続けると考えられる.B.1.617.2 Sタンパク質がWT Sよりも多くの細胞間融合(cell-to-cell fusion)を引き起こすという観察結果は,B.1.617.2がこれまでの変異ウイルスよりも多くの組織傷害を引き起こし,その結果,より病原性が高い,あるいは合胞体形成を介したウイルス拡散がこの変異ウイルスの効率的な宿主間および宿主内拡散に寄与している可能性を示唆しているcell lineを用いた侵入実験は慎重に解釈する必要があり,初代細胞(primary cells)での確認は保留されている.しかし,大腸cell linesCaco-2細胞および肺cell linesCalu-3細胞への侵入がそれぞれ有意に増加したことから,B.1.617.2はこれらの臓器への感染能力が増強されている可能性があり,そして呼吸器上皮への感染が増加したことが,B.1.617.2の伝播性の増加を説明している可能性がある