COVID-19関連追加(20211018日)

レクチンによる感染増強と中和抗体への影響

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2021526日(増強抗体による非古典的ADE

【レクチンはSARS-CoV-2感染を増強し,中和抗体に影響する】

Lempp, F.A., Soriaga, L.B., Montiel-Ruiz, M. et al. Lectins enhance SARS-CoV-2 infection and influence neutralizing antibodies. Nature 598, 342–347 (2021).

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03925-1.

Abstract

SARS-CoV-2感染は,細胞付着と膜融合を伴い,アンジオテンシン変換酵素2ACE2)受容体に依存している.ACE2受容体は,逆説的に呼吸器では発現は低レベルであり1)2)3),感染を促進する別のメカニズムがあることが示唆されている本研究では,C型レクチン受容体であるDC-SIGNL-SIGNおよびシアル酸結合Ig様レクチン1SIGLEC1)が,ACE2介在性感染を促進し,異なるクラスのスパイク特異的抗体の中和活性を調節することにより,付着受容体として機能することを示したアミノ末端ドメインまたは受容体結合ドメインの基部にあるconserved siteに対する抗体は,ACE2過剰発現細胞の感染を中和する活性は低いが,レクチンによって促進される感染を効果的に遮断する逆に,受容体結合モチーフに対する抗体は,ACE2過剰発現細胞への感染を強力に中和するが,DC-SIGNL-SIGNを発現している細胞への感染はほとんど中和せず,スパイクの融合性再構成(fusogenic rearrangement)を引き起こし,細胞間融合(cell-to-cell fusion)を促進する.これらの結果から,SARS-CoV-2ACE2依存性感染を増強するレクチン依存性経路が明らかになり,スパイク特異的抗体による中和のメカニズムが異なることがわかった.

 

Main

SARS-CoV-2は,スパイク(S)糖タンパク質を介して標的細胞に感染する.スパイク糖タンパク質は,S1サブユニットとS2サブユニットで構成される各単量体とともにホモ三量体として組織されている4).感染プロセスは,細胞への結合,Sの構造変化の誘発,ウイルスエンベロープの標的細胞膜への融合などである.SS1サブユニットは,N末端ドメイン(NTD受容体結合ドメイン(RBDから構成されているRBDは,受容体結合モチーフ(RBMと呼ばれる領域を介してACE2と相互作用するRBDに対する抗体は,ポリクローナル血清抗体の中和活性の大部分を占めており5)6)in vitroSARS-CoV-2を強力に中和し7)8)COVID-19の予防および早期治療の臨床試験で有効性が示されている9)10)

SARS-CoV-2を中和する抗体の探索には,ACE2受容体を過剰発現する標的細胞を用いることが有効とされている11)しかし,下気道におけるACE2の発現は限られており,ごく少数のII型肺胞基底細胞,杯細胞,粘液細胞にのみ低レベルの発現が認められる1)2)3)肺でのACE2レベルが低く,他の組織での感染が肺外合併症を引き起こす12)というパラドックスは,DC-SIGNCD209としても知られる)L-SIGNCD209LまたはCLEC4Mとしても知られる),ニューロピリン-1NRP-1),バシジン(CD147としても知られる),またはヘパラン硫酸のような,追加された受容体がウイルス感染と播種に寄与している可能性を提起している14)13)15)16)17)これらの分子が,ウイルス侵入における代替の主要受容体(alternative primary receptors)として作用するのか,共受容体(co-receptors)として作用するのか,あるいはウイルス粒子を繋ぎ止めて,ACE2との相互作用を高める付着受容体(attachment receptors)として作用するのかは,まだ解明されていない

本研究で我々は,ACE2依存性感染を増強する付着受容体として,DC-SIGNL-SIGNSIGLEC1CD169sialoadhesin,あるいはSiglec-1としても知られている)を同定し,そしてレクチン存在下または非存在下で,RBM部位と非RBM部位を標的とした抗体による異なる中和メカニズムを実証した.

Results

Lectins are attachment receptors for SARS-CoV-2:

SARS-CoV-2感染の付着受容体を同定するためのアッセイを開発するために,我々は,低い内因性レベルのACE2を発現するHEK 293T細胞を使用した.HEK 293T細胞に,ACE2をエンコードするベクター,または13種類の選択されたレクチンと公表されている受容体候補のうちの1つをトランスフェクトしてから,水胞性口炎ウイルス(VSVSARS-CoV-2疑似ウイルスを感染させた.トランスフェクトしていないHEK 293T細胞は、感染に対する許容は弱かったが,ACE2過剰発現によって,疑似ウイルスの侵入が顕著に増加したまた,HEK 293T細胞にC型レクチンDC-SIGNL-SIGN(これらは侵入受容体として報告されている13)14)18)),およびSARS-CoV-2の侵入を媒介することは明らかになっていないSIGLEC1をトランスフェクションしたところ,感染性の増加が認められた(Fig. 1aNRP-1CD147は,侵入受容体としての作用が示唆されているが15)16),これらの条件ではSARS-CoV-2の感染を増強しなかった.また,3つのレクチンの感染増強活性は,これらの因子を安定的に発現しているcell lines上のauthentic SARS-CoV-2で観察された(Fig. 1b, Extended Data Fig. 1a–d).SIGLEC1を阻止する抗体は,SIGLEC1を発現しているHEK 293T細胞の感染を阻害したことから,この分子がSARS-CoV-2co-factorとしての役割を果たしていることが示唆された(Fig. 1c

Fig. 1: DC-SIGN, L-SIGN and SIGLEC1 function as attachment receptors for SARS-CoV-2 infection.

a, VSV-SARS-CoV-2 infection of HEK 293T cells transfected to express ACE2 or a panel of selected lectins or candidate receptors (n = 4 biologically independent replicates). RLU, relative luminescence units. b, Stable cell lines were infected with SARS-CoV-2-Nluc and luciferase levels were quantified at 24h (n = 6). c, Inhibition of SARS-CoV-2-Nluc infection with anti-SIGLEC1 monoclonal antibody (clone 7-239) (n = 3). d, Indicated cell lines were transduced to express lectins or ACE2 and infected with VSV-SARS-CoV-2 (n = 8). e, Effect of ACE2 siRNA transfection on infection with VSV-SARS-CoV-2 (n = 8).

Fig. 1

DC-SIGNL-SIGNSIGLEC1を異所性に発現させても,HeLa細胞やMRC-5細胞などのACE2陰性細胞への感染は支持されず(Fig. 1d),これらのレクチンは主要エントリー受容体(primary entry receptors)としては機能しないことが示された.また,ACE2阻止抗体(ACE2-blocking antibodies)やACE2 small interfering RNAsiRNA)を用いても,レクチン発現細胞へのウイルス感染にACE2が必要であることが示された(Fig. 1e, Extended Data Fig. 1e).

これらのデータを総合すると,低レベルのACE2を発現している細胞では,レクチン促進性経路が明らかになり,SARS-CoV-2がレクチンをウイルス粒子の付着受容体(attachment receptors)として利用し,それによってACE2との相互作用を促進している可能性がある

Extended Data Fig. 1: Characterization of DC-SIGN, L-SIGN and SIGLEC-1 as SARS-CoV-2 attachment factors.

a–b, Binding of antibodies targeting DC/-L-SIGN, DC-SIGN, SIGLEC1 or ACE2 on HEK293T stably over-expressing the respective attachment receptors was analyzed by flow cytometry (a) and immunofluorescence analysis (b) (scale bar: 50µm). c, Stable HEK293T cell lines overexpressing lectins or ACE2 were infected with authentic SARS-CoV-2 (MOI 0.1) and immunostained at 24 h for nucleocapsid protein (red) (scale bar: 100µm). d, HEK293T cells over-expressing the respective attachment receptors were infected with VSV-SARS-COV-2 wildtype spike (grey bars) or spike bearing mutations of the B.1.1.7 variant (red bars). Luminescence was analyzed one day post infection (n=4 biologically independent replicates). e, Stable cell lines were incubated with anti-ACE2 polyclonal antibodies and infected with VSV-SARS-CoV-2 (n=3 biologically independent replicates).

Extended Data Fig. 1

Attachment receptors facilitate trans infection:

ACE2との相互作用は,HIV-1で報告されているように19)cis or transでも起こりうる.ACE2とレクチンが同じ細胞に存在するかどうか(すなわち,in cis)に取り組むために,肺細胞アトラス20)を調べた(Extended Data Fig. 2a).DC-SIGNIGSF21+樹状細胞に最も顕著に発現し,L-SIGNは血管構造に限定的に発現し,SIGLEC1は肺胞マクロファージ,樹状細胞,単球の表面に広く発現していたACE2の発現は,U型肺胞上皮細胞,基底細胞,杯細胞のサブセットに限られている.我々はそれから,重症COVID-19患者21)の気管支肺胞洗浄液(BAL)または喀痰から得られた3,085個の肺胞上皮細胞および免疫細胞のシングルセル・トランスクリプトームデータ(single-cell transcriptomic data)を解析した.細胞あたりのウイルスRNAの分布は、アノテーション(=直訳すると注釈)された細胞タイプによって異なっていた.特に,マクロファージのウイルスRNAの含有量は,分泌細胞に比べて多かった(P< 2.2×10-16)(Extended Data Fig.2bSIGLEC1は,SARS-CoV-2+マクロファージの41.4%1,107細胞のうち459細胞)で発現していたが,ACE2の発現はこれらの細胞ではごくわずかだった(Fig. 2a.逆に,SARS-CoV-2+分泌細胞の10.6%565細胞のうち60細胞)では,ACE2の発現が認められたが,SIGLEC1の発現はごくわずかであった.全データセット(SARS-CoV-2が検出されないBALや喀痰の細胞を含む)では,1,037個の細胞が樹状細胞(DCs: dendritic cells)としてアノテーションされ,そのうち349個(34.6%)がSIGLEC1+であった.合計すると,DCs1,037個のうち19個(2%未満)にSARS-CoV-2が検出され,そのうち47%19個のうち9個)にSIGLEC1発現の検出が可能であった.SIGLEC1DC-SIGNL-SIGNの発現量をSARS-CoV-2ウイルス量の関数としてプロットしたところ,マクロファージでは,SIGLEC1で強い正の相関が見られた(Fig. 2a.我々は,この関連性を,重症COVID-19患者22)SARS-CoV-2+ BAL細胞1,072個からなる別のトランスクリプトームデータセットで確認した.我々は,SARS-CoV-2+ BAL細胞におけるウイルスRNAの性質を評価するために,このデータセットから入手可能なシーケンスリードを調べた.SARS-CoV-2+ BAL細胞は,マクロファージやその他の非上皮性細胞からなる細胞集団であり,ウイルス複製は最小限にとどまっていた.

Fig. 2: Expression of attachment receptors in infected tissues and their role in mediating trans infection.

a, Left, heat map matrix showing counts of cells with detected transcripts for receptor gene(s) (x-axis) by SARS-CoV-2+ cell type (y-axis) (n = 3,085 cells; total number of each cell type in parentheses). Right, correlation of receptor transcript counts with SARS-CoV-2 RNA counts in macrophages and secretory cells (transcript-positive cells shown as fraction of total number of cells of that type). Two-sided correlation test is based on counts (before log transformation) from Ren et al. 21). NK, natural killer cells. CPM, counts per million transcripts; NA, not applicable. b, HeLa cells (grey) transduced with lectins (red) were incubated with VSV-SARS-CoV-2 (blue), washed and co-cultured with VeroE6-TMPRSS2 target cells. Infection (RLU) was assayed in the presence or absence of target cells (purple) (n = 16 biologically independent replicates). c, Trans infection performed as in b. Viral adsorption was performed in the presence of an anti-SIGLEC1 antibody (n = 10). d, Transmission of replication-competent SARS-CoV-2 by lipopolysaccharide (LPS)-activated DCs to susceptible target cells. Cells were pre-incubated with the indicated monoclonal antibodies, exposed to SARS-CoV-2, washed and incubated with indicated target HEK 293T cells. Trans infection was measured six days later as viral release in the supernatant. GM-CSF, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; hPBMCs, human peripheral blood mononuclear cells. Data are mean ± s.d. from two independent experiments including cells from five donors. Two-sided paired t-test.

Fig. 2

以上の結果から,これらの受容体は同一細胞内ではほとんど発現していないため,cisにおけるACE2SIGLEC1の協力関係は限定的であり,SIGLEC1+ 骨髄系抗原提示細胞からACE2+ 細胞へのtrans infectionの役割が示唆される実際,レクチンを導入したHeLa細胞は,感受性の高いVero E6-TMPRSS2標的細胞へのVSV-SARS-CoV-2trans infectionを促進する能力が増強されており(Fig. 2b),SIGLEC1阻止抗体によってSIGLEC1を介したtrans infectionが阻害された(Fig. 2c, Extended Data Fig. 2c)

Extended Data Fig. 2: Expression of attachment receptors in infected tissues.

a, Distribution and expression of ACE2, DC-SIGN, L-SIGN, and SIGLEC1 in the human lung cell atlas. b, Major cell types with detectable SARS-CoV-2 genome in bronchoalveolar lavage fluid and sputum of severe COVID-19 patients. Left panel shows a t-SNE embedding of single-cell gene expression profiles coloured by cell type and sized by viral load (logCPM); right panel, distribution plots by annotated cell type denote the cumulative fraction of cells (y-axis) with detected viral RNA per cell up to the corresponding logCPM value (x-axis). Viral RNA is also found in neutrophils, plasma and T cells – an observation that has been reported previously21)64)65)66)67)68)69)70) c, SIGLEC1 surface expression comparison. Mean number of SIGLEC1 antibody binding sites per cell displayed by SIGLEC1 stably transduced cell lines and different myeloid cells left untreated or exposed to IFNα or LPS for 48 h and assessed by quantitative FACS analysis. Data show mean values and SEM from one experiment including cells from 3 donors.

Extended Data Fig. 2

次に我々は,replication-competent SARS-CoV-2を用いて,初代骨髄系細胞におけるウイルスの付着とtrans infectionを評価した.レクチンは,主にマクロファージ,DCs,単球などの抗原提示細胞に発現しており,そしてインターフェロンなどの自然炎症刺激によってレクチンの発現がupregulateされることがある19)マクロファージとDCsはともにSIGLEC1を介してSARS-CoV-2を取り込むことができるが23),マクロファージはウイルスを感知すると主に炎症性サイトカインを放出する23)24).ここで我々は,SIGLEC1が初代DCsから感受性細胞へのtrans infectionに重要な役割を果たしていることを示した.特に我々は,初代活性化DCsは生産的に感染することはできないが,ACE2TMPRSS2を発現する標的細胞へのSARS-CoV-2感染を仲介することができ,この感染は抗SIGLEC1抗体の存在下で減少することがわかった(Fig. 2dIn vivoでは,SARS-CoV-2感染に伴って,ひとたび炎症性DCsが肺組織に移動すると,SIGLEC1を介したtrans infectionが関連し,肺や遠隔組織への感染拡大を助長する可能性がある.これらの結果は,SARS-CoV-2の播種にレクチンが関与していることを示唆している.

Overexpression of ACE2 impairs neutralization:

ACE2および付着受容体の発現量が中和活性にどのように影響するかを調べるために,Sタンパク質の異なる部位を標的とする3つのモノクローナル抗体を比較した: (1)RBDRBM site Ia/class 1を標的とする7)S2E12; (2)RBM遠位の conserved N-glycan-containing site IV/class 3を標的とする25)S309; (3)NTDsite iを標的とする26)S2X333である(Fig. 3a).これらのモノクローナル抗体は,力価は異なるものの,Vero E6細胞へのauthintic SARS-CoV-2感染を完全に中和し,そしてその活性はTMPRSS2プロテアーゼの発現の影響を受けなかった(Extended Data Fig. 3a, b).受容体の発現が中和に及ぼす影響を理解するために,ACE2TMPRSS21,000倍を超えるレベルで発現するcell lines(内因性または形質導入[transduction]により)を用いた(Fig. 3b, Extended Data Fig. 3c, d).RBMモノクローナル抗体S2E12は,すべての標的細胞に対して同等の中和活性を示したが,一方,S309S2X333は,ACE2を過剰発現させた細胞で実験すると,最大中和および効力の両方の観点から中和活性が障害された(Fig. 3c, d).VSV-SARS-CoV-2authentic SARS-CoV-2-Nlucnanoluciferaseを発現する感染性SARS-CoV-2クローン)でも同様の結果が得られた.全体として,非RBMモノクローナル抗体では,ACE2レベルと中和能に負の相関が見られた(Extended Data Fig. 3e

 

 

Fig. 3: ACE2 overexpression influences neutralization by different classes of monoclonal antibodies.

a, Surface rendering of a composite model of SARS-CoV-2 S bound to S309 (purple), S2E12 (magenta) and S2X333 (orange)7)25)26). The three SARS-CoV-2 S protomers are coloured light blue, gold and pink with N-linked glycans rendered dark blue. b, SARS-CoV-2 S or RBD binding to the indicated cell lines was quantified by flow cytometry. A, ACE2; T, TMPRSS2. Graph shows mean of two biological replicates. MFI, mean fluorescence intensity. c, d, A panel of seven cell lines was infected with SARS-CoV-2-Nluc (c) or VSV-SARS-CoV-2 pseudovirus (d) in the presence of S309, S2E12 or S2X333. Luciferase signals were quantified 24 h after infection (n = 3 biologically independent replicates).

Fig. 3

 

Extended Data Fig. 3: Characterization of SARS-CoV-2-susceptible cell lines.

a, SARS-CoV-2 neutralization with S309, S2E12 and S2X333 on Vero E6 or Vero E6-TMPRSS2 cells. Cells were infected with SARS-CoV-2 (isolate USA-WA1/2020) at MOI 0.01 in the presence of the respective mAbs. Cells were fixed 24h post infection, viral nucleocapsid protein was immunostained and quantified (n=3 biologically independent replicates). b, IFA images of experiment in (a): SARS-CoV-2 neutralization with 10µg/ml of S309, S2E12 and S2X333 on Vero E6 or Vero E6-TMPRSS2 cells (scale bar: 100µm). c, Purified, fluorescently-labelled SARS-CoV-2 spike protein or RBD protein was incubated with the indicated cell lines and protein binding was quantified by flow cytometry. d, Cellular ACE2 and TMPRSS2 transcripts were quantified by RT-qPCR. Expression levels were adjusted by HPRT levels and are presented as normalized to HeLa cell levels, showing the mean of technical triplicates. e, Correlation analysis between ACE2 transcript levels and maximum antibody neutralization in all SARS-CoV-2-susceptible cell lines. Nonparametric, two-tailed Spearman correlation was calculated using GraphPad Prism.

Extended Data Fig. 3

このように,in vitroでの感染防御の相関性が不明瞭であることを考慮し,SARS-CoV-2感染を予防するために,ハムスター化(hamsterizedS309およびS2E12モノクローナル抗体を,ACE2の内因性発現を利用した動物モデルである27)シリアン・ハムスターに投与した.予防的なセッティングにおいて,S309は,0.4 mg/kgという低用量で,肺におけるウイルスRNA,感染ウイルス量,病理組織学的スコアの減少という点で,高い効果を示した(Extended Data Fig. 4a.さらに我々は,S309と,それと同量の強力なRBM S2E12モノクローナル抗体を併用しても,有効性の大幅な上昇は認められなかった(Extended Data Fig. 4b).ハムスター化S309モノクローナル抗体の「Fc-silenced」バージョン(GH-S309-N297A)(Extended Data Fig. 5)も同様に,ハムスターのSARS-CoV-2曝露に対して防御的であり,S309の中和活性がこの病態における主要な作用機序であることが強調された

Extended Data Fig. 4: S309 or a cocktail of S309 and S2E12 provide robust in vivo protection against SARS-CoV-2 challenge.

Syrian hamsters (n=419) were injected with the indicated amount of mAb(s) 48h before intra-nasal challenge with SARS-CoV-2. ab, Quantification of viral RNA in the lungs 4 days post-infection. **** p<0.0001 vs C; °° p=0.0023 4 vs 0.1, p=0,0096 1.5 vs 0.1. cd, Quantification of replicating virus in lung homogenates harvested 4 days post infection using a TCID50 assay. **** p<0.0001 vs C; *** p=0.0002 1.5 vs C; * p=0.0146 0.4 vs C; °° p=0.0056 4 vs 0.1; ° p=0.0236 1.5 vs 0.1. e–f, Histopathological score of the lung tissue was assessed 4 days post infection. *** p=0.0005 vs C; * p=0.0369 vs C. Nonparametric one-way ANOVA, Kruskal-Wallis test with Dunns multiple comparisons test (alpha threshold 0.05). Data are from at least 2 independent experiments, except the group dosed with 0.1 mg/kg (n=4) that was tested once. gh, Efficacy plots based on the correlation between the level of serum antibody measured at the time of infection and the level of SARS-CoV2 (viral RNA) measured in lungs on day 4 after infection. The dotted lines represents EC50 and EC90 for viral reduction (EC90 of S309 alone vs S309+S2E12: 9 vs 11µg/ml, respectively).

 

 

Extended Data Fig. 4

Extended Data Fig. 5: Binding of immunocomplexes to hamster splenocytes/FcgR and role of host effector function in SARS-CoV-2 challenge.

Alexa-488 fluorescent IC were titrated (0–200 nM range) and incubated with total naïve hamster splenocytes. Binding was revealed with a cytometer upon exclusion of dead/apoptotic cells and physical gating on bona fide monocyte population. a, fluorescent intensity associated to hamster cells of immune-complex (IC) made with either hamster (GH-S309, dark grey and GH-S309-N297A, blue) or human (Hu-S309, green) Fc antibodies. A single replicate of two is shown. b, relative Alexa-488 mean fluorescent intensity of the replicates measured on the entire monocyte population. Data are from a single representative experiment repeated three times with similar results. c–d, kinetics of binding of the same hamster and human ICs to hamster FcgRIV (panel C) and human FcgRIIIA (panel D) by Octet BLI analysis. e–g, Syrian hamsters (n=6) were injected with the indicated amount (mg/kg) of hamster IgG2a S309 either wt or Fc silenced (S309-N297A). e, Quantification of viral RNA in the lung 4 days post infection. ** p=0.0022 vs control. f, Quantification of replicating virus in the lung 4 days post infection. ** p=0.0022 vs control g, Histopathological score in the lung 4 days post infection. ** p=0.0022 vs C; * p=0.0411 1.5 (N297A) vs C, p=0.0130 4 (N297A) vs control. Control animals (white symbols) were injected with 4 mg/kg unrelated control isotype mAb. 2-tailed nonparametric Mann-Whitney t test (alpha threshold 0.05). Data are from a single experiment.

 

 

Extended Data Fig. 5

これらのデータを総合すると,ACE2を過剰発現させた細胞を用いた中和アッセイでは,非RBMモノクローナル抗体の中和活性が過小評価されていることを示している(それは関連する感染動物モデルにおいてRBMモノクローナル抗体と同様に防御的である28)この知見の重要性は,VIR-7831S309の誘導体モノクローナル抗体)の第3相臨床試験において,COVID-19による入院および死亡を85%予防したという有効性のデータからも裏付けられている29)

Antibody-mediated membrane fusion:

Permissive cells※a permissive cell or host is one that allows a virus to circumvent its defenses and replicate. Usually this occurs when the virus has modulated one or several of the host cellular intrinsic defenses and the host immune system)の感染には,ACE2や付着受容体との相互作用と、ウイルス膜と細胞膜との融合の両方が関与している.我々は,ウイルスの侵入だけでなく,細胞間融合にも関与するウイルス融合事象(これは,in vitroでの合胞体(syncytia)形成30)や,感染者のヒト肺における多核巨細胞(multi nucleate giant cells)形成31)につながる)を,異なるクラスのS特異的抗体がどのように妨害するかを調べた.RBM特異的SARS-CoV中和モノクローナル抗体は,ACE2模倣体(mimics)として作用し,Sタンパク質の融合性再構成を誘発する32).我々は,エピトープ特異性の異なるモノクローナル抗体(Extended Data Table 1)を用いて,可溶性Sタンパク質三量体の融合性再構成を誘発するかどうかを,それぞれのモノクローナル抗体のFabフラグメントを用いてnegative-stain electron microscopy imagingで測定した(Extended Data Fig. 6a).5つのRBMモノクローナル抗体は,native SARS-CoV-2 S ectodomain trimerの融合後の状態への再構成を引き起こしたが,これはおそらくオープンRBDsのコンフォメーション選択(conformational selection of open RBDs)によるものであろう.これらのモノクローナル抗体のほとんどは,S再構成を迅速に引き起こすが,S2D106はよりゆっくりと引き起こした.予想通り、隣接するRBDを閉じた状態に固定するRBMモノクローナル抗体であるS2M117),融合性S再構成を引き起こさなかった.また,オープンRBDsのコンフォメーション選択の欠如のため,NTDに対する抗体(S2X333),RBDIb部位に対する抗体(REGN10987LyCoV555),RBD基部のN-グリカン含有部位に対する抗体(S309)は再構成を誘発しなかった.

融合性再構成の抗体介在性誘発が膜融合を促進するかどうかを調べるために,我々は全長SARS-CoV-2 Sを安定的に導入したCHO細胞(ACE2発現を欠く)の細胞間融合を誘発する能力について,モノクローナル抗体のパネルを評価した.合胞体形成は、オープンRBD状態でのみアクセス可能な抗原部位IaおよびIIaExtended Data Table 1)を認識するすべてのモノクローナル抗体によって引き起こされ,50%最大効果濃度(EC50: half-maximum effective concentration)は、S2E1220 ng/mlからS2D106>1 μg/mlの範囲であった(Extended Data Fig. 6b–d).また,臨床段階にある3つのモノクローナル抗体でも合胞体が形成された: REGN10933casirivimab),Ly-CoV016etesevimab),CT-P59regdanvimab).一方,open/closed RBD状態(S2M11, S309, Ly-CoV555[bamlanivimab], REGN10987[imdevimab])、NTDS2X333),あるいはS2 subunit stem helixの保存部位(S2P633)に結合するモノクローナル抗体の存在下では,合胞体は形成されなかった.本研究でIb部位に結合すると構造的に定義されたモノクローナル抗体であり,open/closed RBDsにアクセスすることができるS2X5834は例外的であった(Extended Data Fig. 7).注目すべきは,S2E12 Fabを用いた場合にも合胞体が形成されたことであり,これは細胞間融合が対向する細胞に発現したSの架橋のみに起因するものではないことを示している(Extended Data Fig. 6gまた,融合抗体と非融合抗体の相互作用の可能性については,S2E12によって誘発された合胞体形成が,S2M11closed状態でRBDをロックする),S309RBDの基部にあるN-グリカン含有部位を標的とする),S2P6S2stem helixを不安定にする)といった異なるクラスの抗体によって阻害されることがわかった(Extended Data Fig. 6e.これらの結果は,異なる抗体の組み合わせが,膜融合を促進したり阻害したりすることで,互いに干渉し合う可能性があることを示している.

 

Extended Data Table 1 mAbs used in this study:

Extended Data Fig. 6: RBM mAbs trigger the fusogenic rearrangmement of the S protein and promote membrane fusion.

a, MAbs or soluble ACE2 were incubated for 1h with native-like soluble prefusion S trimer of SARS-CoV-2 to track by negative stain EM imaging the fusogenic rearrangement of soluble S trimers visible as rosettes (scale bar: 20 nm). 100 micrographs per sample were analyzed. b, Cell-cell fusion of CHO cells expressing SARS-CoV-2 S (CHO-S) on the plasma membrane in the absence (upper panel) or presence of 5µg/ml of S2E12 mAb (lower panel) as detected by immunofluorescence. Nuclei stained with Hoechst dye; cytoplasm stained with CellTracker Green (scale bar: 100µm). c, CHO-S cell-cell fusion mediated by different spike-specific mAbs quantified as described in Methods. d, Structures of 11 Fab-RBD complexes related to mAbs used in (c) (RBD orientation is fixed) and of ACE2-RBD as determined by a combination of X-ray crystallography and cryo-EM analysis (PDBs, Extended Data Table 1). Shown in parentheses the RBD antigenic site as defined according to Piccoli et al. 5. e, Inhibition of S2E12-induced cell-cell fusion performed as in (c) by a fixed amount (15µg/ml) of indicated mAbs. f, Trans-fusion of S-positive CHO cells with S-negative fluorescently-labelled CHO cells. Staining as in (b) (scale bar: 300µm, inlet 50µm). g, CHO-S cells were seeded in 96-well plates an incubated with S2E12 IgG or Fab. Cell-Cell fusion was quantified by imaging as described in methods.

Extended Data Fig. 6

Extended Data Fig. 7: Data collection and processing of the S/S2X58 complex cryoEM datasets.

a-b, Representative electron micrograph and 2D class averages of SARS-CoV-2 S in complex with the S2X58 Fab embedded in vitreous ice. Scale bar: 400 Å. c, Gold-standard Fourier shell correlation curves for the S2X58-bound SARS-CoV-2 S trimer in one RBD closed (black line) and three RBDs open conformations (gray line). The 0.143 cutoff is indicated by a horizontal dashed line. Due to steric clashes between the S2X58 Fab and the NTD of a neighboring monomer in the closed S state, this mAb appears to conformationally select the open RBDs, thus explaining its fusogenic activity. d, Local resolution maps calculated using cryoSPARC for the SARS-CoV-2 S/S2X58 Fab complex structure with one RBD closed and three RBDs open shown in two orthogonal orientations. e, Cryo-EM data collection statistics.

Extended Data Fig. 7

抗体が感染の細胞間伝播を促進するかどうかに取り組むために,S陽性CHO細胞とS陰性蛍光標識CHO細胞を共培養した.この条件では,S2E12は,ACE2非存在下で,S陽性CHO細胞とS陰性CHO細胞との一方向的な融合(unidirectional fusion)(ここでは「trans fusion」と定義)を促進した(Extended Data Fig. 6f).このメカニズムが,tethered virusACE2に依存しない感染も媒介している可能性があるかどうかを検討するために,我々は,融合を促進するモノクローナル抗体を異なる希釈で存在させた状態で,live SARS-CoV-2-NlucウイルスをHeLa-DC-SIGN細胞に感染させた.この条件では,S2E12S2D106S2X58は感染を促進しなかった(Extended Data Fig. 8a).これらの知見を総合すると,抗体濃度と細胞間の接近度(cell-cell proximity)が一定の条件下では,RBDのオープンコンフォメーションに選択的なRBM抗体のサブクラスが,ACE2陰性細胞との細胞間融合を促進する可能性があることを示しているしかし,これらのモノクローナル抗体の融合活性は,ACE2非存在下では細胞表面に繋がれた(tethered)ビリオンの侵入を促進するには十分でない可能性がある.以前,in vitroFcγRIIa発現細胞によって捕捉された抗MERS-CoV中和モノクローナル抗体で観察されたように35)RBMモノクローナル抗体が他の条件下でACE2非依存的なSARS-CoV-2の侵入を媒介するかどうかは,まだ確定していない.

Extended Data Fig. 8: SARS-CoV-2 live virus neutralization.

a, HeLa cells expressing DC-SIGN are refractory to SARS-CoV-2 infection. HEK293T or HeLa cells stably expressing DC-SIGN were infected with SARS-CoV-2-Nluc at MOI 0.04 in the presence of the indicated antibodies. Infection was analyzed by quantification of luminescent signal at 24 h post infection (n=2 biologically independent replicates). b, Neutralization of infection by SARS-CoV-2-Nluc pre-incubated with the stem helix antibody S2P6 on HEK293T cell lines stably overexpressing lectins or ACE2. Infection was measured by luciferase signal 24h post infection (n=3 biologically independent replicates) c, Infection neutralization by authentic SARS-CoV-2-Nluc pre-incubated with indicated mAbs on HEK293T cell lines stably overexpressing L-SIGN (n=3 biologically independent replicates). Infection was measured by luciferase signal 24h post infection (n=3 biologically independent replicates). d, HEK293T cells stably expressing ACE2 or lectins were infected with SARS-CoV-2 at MOI 0.02 in the presence of the indicated mAbs. Cells were fixed 24h post infection, viral nucleocapsid protein was immunostained and positive cells were quantified (n=3 biologically independent replicates). e, Summary of the mechanisms of action of different classes of spike-specific mAbs based on this and previous studies. *, mAb-mediated inhibition of fusion between CHO-spike cells and ACE2+ Vero-E6 cells; **, based on mAb-dependent activation of human FcgRs performed with a bioluminescent reporter assay as in ref. 25 æ, S2X58 binds to open RBD due to a conformational clash with neighboring NTD.

Extended Data Fig. 8

Lectin receptors modulate neutralization:

ある種のRBM抗体がACE2結合を阻害し,融合を誘発するという二重の機能を持っていることと,特定の抗体による中和が付着受容体の発現に依存していることを考慮して,authentic SARS-CoV-2と,異なるレベルのACE2およびレクチン受容体を発現している標的細胞を用いて,モノクローナル抗体パネルの中和活性を比較した.ACE2を過剰に発現させた細胞(cells overexpressing ACE2)を用いた実験では,すべての抗RBMモノクローナル抗体が感染を強力に中和したのに対し,非RBMモノクローナル抗体のS309S2X333は中和しなかった(Figs. 3, 4a, dしかし,低レベルのACE2SIGLEC1DC-SIGN,またはL-SIGNを同時に発現している細胞で実験した場合,S309S2X333は中和活性を高め,S309100%の中和に到達した注目すべきは,すべてのRBMモノクローナル抗体がSIGLEC1+細胞に対する中和活性を保持していたのに対し,いくつかのRBMモノクローナル抗体(S2D106S2X58REGN10987REGN10933LyCoV555)は,DC-SIGNまたはL-SIGNを発現している細胞に対する中和活性を失い,実験した最高濃度でも部分的な中和しか示さなかったことである(Fig. 4b, c, e, f, Extended Data Fig. 8c–eDC-SIGNおよびL-SIGNを発現している細胞で観察されたS2X58およびS2D106モノクローナル抗体の中和活性の喪失は,replication-competent SARS-CoV-2(野生型)およびlive SARS-CoV-2-Nlucの両方で確認された(Extended Data Fig. 8d).しかし,いずれの中和モノクローナル抗体も,DC-SIGNまたはSIGLEC1を発現しているHeLa細胞からVero-E6-TMPRSS2標的細胞へのtrans infectionを阻止した(Extended Data Fig. 9これらのデータを総合すると,異なるクラスのモノクローナル抗体によるウイルスのcisまたはtrans infectionの中和には,エピトープの特異性,結合価,および融合性再構成を引き起こす能力によって,阻止効率が異なるという複雑なパターンがあることが明らかになった

Fig. 4: SIGLEC1, DC-SIGN and L-SIGN modulate neutralization by different classes of antibodies.

a–f, Neutralization of infection with SARS-CoV-2-Nluc pre-incubated with indicated monoclonal antibodies on HEK 293T cell lines stably overexpressing lectins or ACE2. Infection was measured by luciferase signal 24 h after infection (n = 3 biologically independent replicates).

Fig. 4

Extended Data Fig. 9: Trans-infection neutralization.

HeLa cells transduced with DC-SIGN (a) or SIGLEC1 (b) were incubated with VSV-SARS-CoV-2, extensively washed and incubated with serial dilutions of anti-spike antibodies. After 30min, susceptible target cells (Vero-E6-TMPRSS2) were added for co-culture. Luminescence signal was quantified 24h post co-culturing to determine trans-infection levels (n=3 biologically independent replicates).

 

 

 

Extended Data Fig. 9

 

Discussion

我々は,膜貫通型レクチンSARS-CoV-2の侵入受容体ではなく付着受容体として働くことで13)14)正統的な(canonicalACE2経路による感染を促進することを示した.この発見は,たとえインターフェロン存在下でも、ACE2の発現レベルが逆説的に低いにもかかわらず,下気道感染が効率的に行われることを示している36)37)SARS-CoV-2感染におけるレクチンの付着の役割は、細胞膜や病原体の表面に特徴的なN-グリカンと結合してtrans infection= 感染を運ぶ)を促進するという,これらの接着分子の既知の生物学と一致している38)SIGLEC1は、ウイルスRNAと関係がある肺の骨髄系細胞に顕著に見られることから,骨髄系細胞が生産的な感染(productive infection)の直接標的となるのではなく,骨髄系細胞による,trans infection,組織への播種,免疫応答の誘発というモデルを裏付けるものとして,特に関連している39).また,動物モデルでは,ウイルスの病原性に付着受容体が関与していることが示唆されている40)41)

レクチン受容体の発現は,異なるクラスのS特異的モノクローナル抗体の中和活性に影響を与える.さらに,様々なモノクローナル抗体が融合事象を妨害する能力を持っていることも観察されている.我々は,SARS-CoVおよびMERS-CoVに関する最初の観察32)35)を発展させ,ほとんどのRBMモノクローナル抗体が,効率は異なるものの,Sの融合性再構成を引き起こすことができることを示したRBDをオープンコンフォメーションで安定化させることで,これらの抗体は受容体模倣体(receptor mimicsとして機能するかもしれない.premature conformational triggeringにより,Sタンパク質が生産的な感染を引き起こす可能性が失われること(我々はこのメカニズムをスパイクの不活性化と呼んでいる)が,このクラスの抗体のウイルス中和の主要な様式である可能性を示唆しているしかし我々は,これらの抗体が,S発現細胞が隣接した細胞(たとえACE2が発現していなくても)とともに,その融合を促進することも示した.これらのデータは,RBMモノクローナル抗体のサブセットが,Sを媒介とした膜融合や合胞体(syncytia)形成を促進することを報告した最近の研究と一致している42).注目すべきは,重症COVID-19症例から採取された剖検サンプルでは,合胞体形成が観察されていることである31)43)44)融合抗体(fusogenic antibodiesは非常に効果的ではあるが9)10),さらに後期における感染や炎症の拡大に寄与している可能性を推測したい(it is tempting to speculate

今回の研究では,SARS-CoV-2中和抗体の序列は,ACE2発現レベルと付着受容体の存在に大きく依存するという知見が注目され,特異的な抗体によって増強される可能性のあるmultinucleate viral factories形成につながるメカニズムが明らかになった.

 

 

References

1) Hikmet, F. et al. The protein expression profile of ACE2 in human tissues. Mol. Syst. Biol. 16, e9610 (2020).

2) Hou, Y. J. et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell 182, 429–446.e14 (2020).

3) Zou, X. et al. Single-cell RNA-seq data analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to 2019-nCoV infection. Front. Med. 14, 185–192 (2020).

4) Walls, A. C. et al. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell 181, 281–292.e6 (2020).

5) Piccoli, L. et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell 183, 1024–1042.e21 (2020).

6) Greaney, A. J. et al. Comprehensive mapping of mutations to the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human serum antibodies. Cell Host Microbe 29, 463–476 (2021).

7) Tortorici, M. A. et al. Ultrapotent human antibodies protect against SARS-CoV-2 challenge via multiple mechanisms. Science 370, 950–957 (2020).

8) Hansen, J. et al. Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail. Science 369, 1010–1014 (2020).

9) Chen, P. et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody LY-CoV555 in outpatients with Covid-19. N. Engl. J. Med. 384, 229–237 (2021).

10) Weinreich, D. M. et al. REGN-COV2, a neutralizing antibody cocktail, in outpatients with Covid-19. N. Engl. J. Med. 384, 238–251 (2021).

11) Crawford, K. H. D. et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses 12, 238 (2020).

12) Gustine, J. N. & Jones, D. Immunopathology of hyperinflammation in COVID-19. Am. J. Pathol. 191, 4–17 (2021).

13) Amraie, R. et al. CD209L/L-SIGN and CD209/DC-SIGN act as receptors for SARS-CoV-2. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.06.22.165803 (2020).

14) Soh, W. T. et al. The N-terminal domain of spike glycoprotein mediates SARS-CoV-2 infection by associating with L-SIGN and DC-SIGN. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.11.05.369264 (2020).

15) Wang, K. et al. CD147-spike protein is a novel route for SARS-CoV-2 infection to host cells. Signal Transduct. Target. Ther. 5, 283 (2020).

16) Cantuti-Castelvetri, L. et al. Neuropilin-1 facilitates SARS-CoV-2 cell entry and infectivity. Science 370, 856–860 (2020).

17) Clausen, T. M. et al. SARS-CoV-2 infection depends on cellular heparan sulfate and ACE2. Cell 183, 1043–1057 (2020).

18) Thépaut, M. et al. DC/L-SIGN recognition of spike glycoprotein promotes SARS-CoV-2 trans-infection and can be inhibited by a glycomimetic antagonist. PLoS Pathog. 17, e1009576 (2021).

19) Izquierdo-Useros, N. et al. Siglec-1 is a novel dendritic cell receptor that mediates HIV-1 trans-infection through recognition of viral membrane gangliosides. PLoS Biol. 10, e1001448 (2012).

20) Travaglini, K. J. et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature 587, 619–625 (2020).

21) Ren, X. et al. COVID-19 immune features revealed by a large-scale single cell transcriptome atlas. Cell 184, 1895–1913.e19 (2021).

22) Liao, M. et al. Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19. Nat. Med. 26, 842–844 (2020).

23) Perez-Zsolt, D. et al. Siglec-1 on dendritic cells mediates SARS-CoV-2 trans-infection of target cells while on macrophages triggers proinflammatory responses. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.11.443572 (2021).

24) Lu, Q. et al. SARS-CoV-2 exacerbates proinflammatory responses in myeloid cells through C-type lectin receptors and Tweety family member 2. Immunity 54, 1304–1319.e9 (2021).

25) Pinto, D. et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature 583, 290–295 (2020).

26) McCallum, M. et al. N-terminal domain antigenic mapping reveals a site of vulnerability for SARS-CoV-2. Cell 184, 2332–2347.e16 (2021).

27) Chan, J. F. et al. Simulation of the clinical and pathological manifestations of coronavirus disease 2019 (COVID-19) in a golden Syrian hamster model: implications for disease pathogenesis and transmissibility. Clin. Infect. Dis. 71, 2428–2446 (2020).

28) Baum, A. et al. REGN-COV2 antibodies prevent and treat SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques and hamsters. Science 370, 1110–1115 (2020).

29) Gupta, A. et al. Early Covid-19 treatment with SARS-CoV-2 neutralizing antibody sotrovimab. Preprint at medRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.27.21257096 (2021).

30) Buchrieser, J. et al. Syncytia formation by SARS-CoV-2-infected cells. EMBO J. 40, e107405 (2021).

31) Bussani, R. et al. Persistence of viral RNA, pneumocyte syncytia and thrombosis are hallmarks of advanced COVID-19 pathology. EBioMed. 61, 103104 (2020).

32) Walls, A. C. et al. Unexpected receptor functional mimicry elucidates activation of coronavirus fusion. Cell 176, 1026–1039.e15 (2019).

33) Pinto, D. et al. Broad betacoronavirus neutralization by a stem helix-specific human antibody. Science 373, 1109–1116 (2021).

34) Starr, T. N. et al. SARS-CoV-2 RBD antibodies that maximize breadth and resistance to escape. Nature 597, 97–102 (2021).

35) Wan, Y. et al. Molecular mechanism for antibody-dependent enhancement of coronavirus entry. J. Virol. 94, 69–15 (2020).

36) Blanco-Melo, D. et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell 181, 1036–1045.e9 (2020).

37) Ziegler, C. G. K. et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell 181, 1016–1035.e19 (2020).

38) Chang, Y. C. & Nizet, V. Siglecs at the host–pathogen interface. Adv. Exp. Med. Biol. 1204, 197–214 (2020).

39) Cathcart, A. L. et al. The dual function monoclonal antibodies VIR-7831 and VIR-7832 demonstrate potent in vitro and in vivo activity against SARS-CoV-2. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.03.09.434607 (2021).

40) Sewald, X. et al. Retroviruses use CD169-mediated trans-infection of permissive lymphocytes to establish infection. Science 350, 563–567 (2015).

41) Uchil, P. D. et al. A protective role for the lectin CD169/Siglec-1 against a pathogenic murine retrovirus. Cell Host Microbe 25, 87–100.e10 (2019).

42) Asarnow, D. et al. Structural insight into SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and modulation of syncytia. Cell 184, 3192–3204.e16 (2021).

43) Xu, Z. et al. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. Lancet Respir. Med. 8, 420–422 (2020).

44) Tian, S. et al. Pulmonary pathology of early-phase 2019 novel coronavirus (COVID-19) pneumonia in two patients with lung cancer. J. Thorac. Oncol. 15, 700–704 (2020).

45) Xie, X. et al. A nanoluciferase SARS-CoV-2 for rapid neutralization testing and screening of anti-infective drugs for COVID-19. Nat. Commun. 11, 5214 (2020).

46) Suloway, C. et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J. Struct. Biol. 151, 41–60 (2005).

47) Hsieh, C. L. et al. Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes. Science 369, 1501–1505 (2020).

48) Tegunov, D. & Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat. Methods 16, 1146–1152 (2019).

49) Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J. & Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat. Methods 14, 290–296 (2017).

50) Zivanov, J. et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

51) Punjani, A., Zhang, H. & Fleet, D. J. Non-uniform refinement: adaptive regularization improves single-particle cryo-EM reconstruction. Nat. Methods 17, 1214–1221 (2020).

52) Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ 6, 5–17 (2019).

53) Pettersen, E. F. et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30, 70–82 (2021).

54) Casanal, A., Lohkamp, B. & Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of electron cryo-microscopy and crystallographic data. Protein Sci. 29, 1069–1078 (2020).

55) Corti, D. et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science 333, 850–856 (2011).

56) Tortorici, M. A. et al. Ultrapotent human antibodies protect against SARS-CoV-2 challenge via multiple mechanisms. Science 370, 950–957 (2020).

57) Rodon, J. et al. Identification of plitidepsin as potent inhibitor of SARS-CoV-2-induced cytopathic effect after a drug repurposing screen. Front. Pharmacol. 12, 646676 (2021).

58) Perez-Zsolt, D. et al. Anti-Siglec-1 antibodies block Ebola viral uptake and decrease cytoplasmic viral entry. Nat. Microbiol. 4, 1558–1570 (2019).

59) Boudewijns, R. et al. STAT2 signaling restricts viral dissemination but drives severe pneumonia in SARS-CoV-2 infected hamsters. Nat. Commun. 11, 5838 (2020).

60) Reed, L. J. & Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493–497 (1938).

61) Sanchez-Felipe, L. et al. A single-dose live-attenuated YF17D-vectored SARS-CoV-2 vaccine candidate. Nature 590, 320–325 (2021).

62) Alexandersen, S., Chamings, A. & Bhatta, T. R. SARS-CoV-2 genomic and subgenomic RNAs in diagnostic samples are not an indicator of active replication. Nat. Commun. 11, 6059 (2020).

63) Wu, F. et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature 579, 265–269 (2020).

64) Chua, R. L. et al. COVID-19 severity correlates with airway epithelium–immune cell interactions identified by single-cell analysis. Nat. Biotechnol. 38, 970–979 (2020).

65) Bost, P. et al. Host–viral infection maps reveal signatures of severe COVID-19 patients. Cell 181, 1475–1488.e12 (2020).

66) Tortorici, M. A. et al. Broad sarbecovirus neutralization by a human monoclonal antibody. Nature 597, 103–108 (2021).

67) Shi, R. et al. A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2. Nature 584, 120–124 (2020).

68) Jones, B. E. et al. The neutralizing antibody, LY-CoV555, protects against SARS-CoV-2 infection in nonhuman primates. Sci. Transl. Med. 13, abf1906 (2021).

69) ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group A neutralizing monoclonal antibody for hospitalized patients with Covid-19. N. Engl. J. Med. 384, 905–914 (2021).

70) Kim, C. et al. A therapeutic neutralizing antibody targeting receptor binding domain of SARS-CoV-2 spike protein. Nat. Commun. 12, 288 (2021).