COVID-19関連追加(20211024日)致死例の組織特異性免疫病理

【致死COVID-19の組織特異性免疫病理】

Dorward DA, et al. Tissue-Specific Immunopathology in Fatal COVID-19. Am J Resp Crit Care Med. Nov 20, 2020. https://doi.org/10.1164/rccm.202008-3265OC.

Rationale

生命を脅かすCOVID-19では,コルチコステロイドが死亡率を低下させることから,免疫応答が死亡の原因となっていることが示唆される.この有害な炎症が,主にSARS-CoV-2に対する直接的な反応なのか,それとも独立した免疫病理学的プロセスなのかは不明である.

Objectives

SARS-CoV-2の臓器指向性(organotropism)と臓器特異的炎症反応,およびウイルスの存在や炎症,臓器傷害の関係を明らかにする.

Methods

11例の詳細な死後検査(postmortem examinations)から組織を採取した.マルチプレックスPCRとシーケンスを用いてSARS-CoV-2の臓器嗜好性を,ウイルスのS(スパイク)タンパク質をin situで検出するによる細胞レベルの解析とともに,マッピングした.37の解剖学的部位から炎症の組織学的な証拠を定量化し,マルチプレックス免疫蛍光法を用いて肺の免疫応答を特徴づけた.

Table 1:

Results

Summary:

致死性COVID-19では,主に網内系を含む複数の異常な免疫応答が見られ,そしてこれらはウイルスとは明確に位相的に関連していなかった炎症や臓器機能障害は,SARS-CoV-2 RNAやタンパク質の組織間および細胞内分布に対してマッピングされなかった.肺では動脈炎が確認され,単球/骨髄系に富んだ血管炎であり,肺実質へのマクロファージ/単球系細胞の流入とともに発生したものである.加えて,過剰な反応性形質細胞や鉄含有マクロファージを含む,ステレオタイプの網内系反応の異常が見られ,リンパ組織におけるウイルスの存在とは関連がなかった

 

Mapping SARS-CoV-2 Distribution to Tissue Inflammation:

致死性COVID-19の詳細な組織アトラスを作成するために,剖検時に37の異なる解剖学的組織部位を採取し,ウイルスRNAの分布と宿主免疫応答を特定した(Figure E1).その結果,SARS-CoV-2 RNAはすべての臓器・組織で検出され呼吸器が最も多かったが,消化管,心臓,筋肉でも検出され,そして肝臓,腎臓,その他の臓器では少なかった(Figure 1A, 1B.採取したすべての臓器にSARS-CoV-2 RNAが含まれる可能性があるにもかかわらず,影響を受けた組織部位には患者間で大きな違いが見られた(Figure 1B).発症から死亡までの時間は,PCRで確認されたSARS-CoV-2陽性臓器の数とは相関しなかったFigure 1B and E3.マルチプレックスPCRの結果は,シーケンスによってSARS-CoV-2ゲノムにマッピングされていることが確認され(Figures 1C and 1D),PCRのみのアプローチによるデータと比較して,これらのデータの信頼性が大幅に高まった.また,PCRで確認されたSARS-CoV-2陽性部位からは,ウイルスサブゲノムmRNAviral subgenomic mRNA)(主にヌクレオカプシド遺伝子由来)が検出され,ウイルスRNA合成が活発に行われていることがわかった(Figure E4

Figure 1:

Mapping severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) organotropism and cellular distribution in fatal coronavirus disease (COVID-19) in relation to tissue inflammation. (A) Distribution of SARS-CoV-2 RNA for all patients was determined by using multiplex PCR (color intensity denotes frequency of detectable RNA; dotted line on legend denotes maximal frequency within the patient cohort) (n=11). The extent of organ-specific inflammation was assessed semiquantitatively (03; no inflammation [0] to severe inflammatory changes [3]), with aggregate scores visualized (n=11). (B) Distribution of individual-patient (patients AK) viral RNA presence within organs plotted against the time interval between illness onset and death compared with organ-specific inflammation scores for each patient. *Denotes invasive mechanical ventilation. (C and D) Multiplex PCR–confirmed SARS-CoV-2–positive samples were confirmed by sequencing, with the proportion of the SARS-CoV-2 genome mapped calculated (C) and a representative sequence-coverage map of the respiratory tract of one patient shown (D). (E and F) Tissue and cellular distribution of SARS-CoV-2 S (spike) protein was evaluated by using immunohistochemistry and multiplex immunofluorescence on randomly selected PCR-confirmed SARS-CoV-2–positive formalin-fixed, paraffin-embedded tissue (n=4 patients). (E) Representative images demonstrate the tissue distribution of S protein within the nasal mucosa, bronchial epithelium, small-bowel enterocytes, distal biliary epithelium within the liver, and distal renal tubular epithelium. (F) Within the lung, cellular localization of S protein is demonstrated within the alveolar epithelium (AE1/3) and is rarely demonstrated in macrophages (CD68) or in the endothelium (CD105) within the lung parenchyma. Scale bars, 50 μm. Misc = miscellaneous.

 

 

SARS-CoV-2 RNAを解析した結果,多くの臓器でSARS-CoV-2の存在が確認されたため,関連する病理学的結果(pathologic consequences)や免疫応答を調べるために,すべての患者の詳細な組織解析が行われた.ウイルスRNA分布とは対照的に,この解析では,網内系だけが広範な炎症反応を起こしていることが示された(Figure 1Aウイルスが存在し,ウイルス転写の証拠がある肺外部位では,大きな局所的炎症は見られなかった

※網内系: 細網内皮系.リンパ管のリンパ洞,脾の静脈洞,肝臓の類洞,骨髄,副腎皮質などの細管の内腔面を覆う細胞よりなる組織でそれらの細胞は貪食能を有し,異物摂取,物質貯蔵,血液細胞造成,抗体形成などの作用がある.

この臓器特異的な病原体と宿主の相互作用を空間的,細胞的なレベルで解明するために,PCRSARS-CoV-2陽性が確認された組織を無作為に選び,SARS-CoV-2 Sタンパク質の存在を評価した.SARS-CoV-2侵入因子の組織内発現に関する最新の報告(19)と同様に,Sタンパク質は主に気道,消化管,肝臓,腎臓の上皮に存在し,肺組織におけるマクロファージ(CD68+細胞)と内皮細胞(CD105+細胞)には限定的であったFigures 1E and 1FSタンパク質は,PCRSARS-CoV-2陰性が確認された一部の組織ではまず検出されず,SARS-CoV-2に感染していない患者の死後組織ではまったく検出されなかった(データは示されていない).肺胞上皮細胞におけるSARS-CoV-2 Sタンパク質の発現は斑状であり,上気道からウイルスを吸引または吸入した可能性と一致したが(20),肺以外の部位での発現では,周囲をタンパク質が検出されない細胞で取り囲まれた隣接細胞内にSARS-CoV-2 Sタンパク質がコンフルエント(confluent)に発現し,境界明瞭な領域がいくつも見られた(Figure 1E.このような「感染の病巣(foci of infection」は,感染した多数の細胞が感染していない細胞と隣接しており,他のコロナウイルスや呼吸器ウイルスで報告されているように,細胞間の拡散(cell-to-cell spreadを示唆している(21, 22)

全体として,我々が観察した,他の臓器における急性炎症の証拠は取るに足らない最小限であった(Figure 1A).慢性疾患の背景にある変化は,既往症を反映していることが多い.全身疾患の重症度に応じて予想される臓器障害も見られた(例えば,機械式換気を受けている患者の腎急性尿細管壊死; Table E3).腎臓(n= 4 detectable),肝臓(n= 4),消化管(n= 7)で検出可能なウイルスRNAは,それぞれ炎症スコア,急性腎傷害の生化学的証拠、ALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)のピーク値,腸管症状とは関連していなかった(Figure E5消化管や内分泌臓器には急性の組織異常は認められず,これらの組織内でウイルスRNAが頻繁に検出されたにもかかわらず心筋炎の症例は認められなかった(Table E3重要なことに,腎臓(n= 4 assessed),腸(n= 3),肝臓(n= 2)内でのウイルスタンパク質の存在は,感染細胞に隣接する局所的な炎症反応とは関連していなかったFigures 1E and 1F and E6

Pulmonary Inflammation and Relationship to SARS-CoV-2:

肺組織の異常は高度でありびまん性肺胞傷害DAD: 急性呼吸窮迫症候群の病理学的特徴),血栓症,気管支肺炎などが頻繁に見られ,その程度は様々であった(Figure 2A予想に反して,SARS-CoV-2 RNAが肺に存在する領域的分布(geographic distribution)と肺の炎症性変化の関係は比例していなかった.また,1人の患者(患者I)では,肺に著名な炎症がなくてもウイルスが検出された.これらの知見は,重症COVID-19の主要なメカニズムの一つは,ウイルスの直接的な細胞毒性というよりもむしろ,ウイルスに依存しない免疫病理であることを強く示唆している

Figure 2:

Delineating pulmonary injury and vascular involvement in fatal coronavirus disease (COVID-19). (A) Detailed spatial evaluation of lung injury and key pathologic abnormalities were determined within each lobe of lung for each patient (patients A–K) and compared with the presence or absence of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral RNA by using multiplex PCR (*denotes invasive mechanical ventilation; n=11). Representative images of organizing and exudative diffuse alveolar damage, pulmonary thrombus, bronchopneumonia, uninflamed lung, and variable inflammation within the same lung. (B) In four individuals, frequent pulmonary vasculature immune infiltration was seen, with (C) multiplex immunofluorescence defining these immune-cell populations (CD4, CD8 [T cells]; CD20 [B cells]; CD68 [macrophages]; MRP8 [neutrophils and myeloid lineage cells]) demonstrating MRP8 immunopositive mononuclear cells to be the predominant cell type (representative image, white stars denote vessel lumen and white dashed line denotes elastic lamina). (D) Analysis of 50 arteries/arterioles from two selected patients quantifying cell types involved in vasculitis. Scale bars, 200 μm. DAD=diffuse alveolar damage; LLL=left lower lobe; LUL=left upper lobe; RLL=right lower lobe; RML=right middle lobe; RUL=right upper lobe.

最近の報告と同様に,複数の患者(11人中8; 小血管のみn= 1, 大血管のみn= 2, 大血管と小血管n= 5)で肺血栓が認められた(Figure 2A).また,11人中4人で,小/中血管の肺動脈内膜を主に侵す,斑状ではあるが顕著な単核細胞血管炎(mononuclear-cell vasculitisが認められた(Figure 2B).この肺動脈性免疫浸潤は,2人の患者(AおよびC)において,マルチプレックス免疫蛍光法を用いてさらに特徴づけられた(Figures 2C and 2D),予想に反して,MRP8+単核細胞が優位な浸潤集団であり,CD4+およびCD8+ T細胞とマクロファージの混合集団を伴っていた(Figures 2C and 2D同じ患者から採取した40の炎症を起こした血管を調べても,表面内皮にSARS-CoV-2 Sタンパク質は確認されなかった(データは示されていない).その他の臓器では,血管炎は見られなかった.

CD8+T細胞の増加と常駐する肺マクロファージ(resident lung macrophages)の減少は,BALF細胞のシングルセル・トランスクリプトミクス(single-cell transcriptomics)を用いて最近報告されている(15).しかし,この方法では,nonluminal pulmonary compartment(※気腔外)における病態生理および免疫変化を過小評価してしまう恐れがある.肺全体の免疫応答を理解するために,肺組織を用いてマルチプレックス免疫表現型解析が行われた(Figures 3A3G and E7).我々の解析では,免疫細胞の最大の増加は,血管/血管周囲よりも肺実質領域内で優位に観察されたFigures 3F and 3Gその結果,最大の相対的増加は単核食細胞のコンパートメント(CD68+/MRP8-マクロファージ、次にCD68+/MRP8+単球性細胞)で認められ,次いでCD8+およびCD4+ T細胞の順であったCD20+細胞やMRP8+/CD68-細胞の増加もより少ないものの認められた

Figure 3:

Pulmonary tissue and reticuloendothelial immune responses to fatal coronavirus disease (COVID-19). Regions of interest were defined by histologic examination of hematoxylin and eosin–stained lung tissue to identify areas of diffuse alveolar damage in tissue from five patients. (A) Representative image. Corresponding multiplex immunofluorescence was used to define vascular-endothelium populations (CD34) relative to immune-cell populations: CD4, CD8 (T cells); CD20 (B cells); CD68 (macrophages); and MRP8 (neutrophils and myeloid lineage cells) (B) with and (C) without autofluorescence. (D and E) Separate cell populations are highlighted. Immune-cell populations were quantified, with the (F) relative abundance of cell types compared between COVID-19 (n=5) and normal, uninflamed lung from patients undergoing lung-cancer resection (n=4) and being (G) spatially stratified into vascular/perivascular and parenchymal regions. (H) Key pathologic abnormalities within bone marrow included erythroid dysplasia, iron-laden macrophages, and hemophagocytosis; plasma cells were confirmed by immunohistochemical staining and quantified in bone-marrow aspirates. + indicates present; ++ indicates frequent. (I) Representative image of bone marrow aspirate analysis demonstrating erythroid dysplasia (white arrows) and frequent plasma cells (red arrows). (J) Mismatch between stereotyped plasma-cell abnormalities in the spleen and mediastinal LN (red) and detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by using multiplex PCR (green, positive; gray, negative). Scale bars, 200 μm. LN=lymph node; P=parenchymal; V=vascular.

 

 

Reticuloendothelial System Responses in Fatal COVID-19:

リンパ節や脾臓でのウイルスRNAの有無にかかわらず,すべての症例で免疫学的変化は重篤かつステレオタイプなパターンが見られた(Figures 3H–3J).骨髄では,赤血球異形成(erythroid dysplasia),形態学的異型を伴う形質細胞過剰(plasma-cell excess with morphologic atypia),鉄貯蔵異常(iron-storage abnormalities)が確認された(Figures 3H and 3I, Figure E8, and Table E4).形質細胞の著しい増加(5%以上)が8つの骨髄吸引(bone marrow aspirates)のうち5つに認められたが,これらの形質細胞はbone marrow trephines上では正常な表現型を持ち,CD56およびサイクリンD1が陰性で、軽鎖免疫化学(light-chain immunohistochemistry)では多型性(polytypic)を示した(Figure E8).鉄含有マクロファージは,1人を除くすべての症例(8人中7人)で認められ、パール染色では豊富な鉄の蓄積を伴っていた.稀ではあるが(1-2/1,000細胞),3人の骨髄では赤血球および/または骨髄前駆細胞の血球貪食が認められた.縦隔リンパ節では,CD38+/MUM1+および弱いCD138+細胞の顕著な反応性形質細胞症(plasmacytosis)が副皮質および髄質に見られ,ある程度の核多形性(nuclear pleomorphism)も示した.脾臓では,白脾髄の萎縮がよく見られ(7人中4人),これは致死性SARSの死後観察結果と同様である(23, 24).赤脾髄はうっ血しており,すべての症例で,縦隔リンパ節で観察されたものと同様の特徴を持った形質細胞が増加していた.

Discussion

本論文で示されたデータは,重症COVID-19を理解する上でいくつかの意味を持つ.

@致死性COVID-19は,ウイルスRNAおよびタンパク質が様々ではあるが,広範囲に分布している.しかし組織間および組織内の局所的なウイルスの存在と炎症反応は一致しないことが示された.臓器傷害が主にSARS-CoV-2に対する適切な局所炎症反応の付随的な傷害であるならば,ウイルスの存在と時間的・空間的な関連性があると予想される.しかし,我々が観察したのは,その逆であった.ウイルスが検出されていない肺の切片に炎症が見られた症例もあった(そして侵襲的機械式換気を受けていない患者において).これは,ウイルスが除去された後に炎症が解消されなかったことに関連しているか,あるいは,ウイルス複製が起こらなかった肺の領域で炎症が起こったことに関連している可能性がある.ウイルス検出のためのPCRの感度を考慮すると,我々は後者の可能性があると考えている.一方,発症から42日後までの間に(たとえ死亡時においても),多くの組織でウイルスの生成物(RNAおよびタンパク質)とウイルスRNA合成の証拠(サブゲノムmRNA)が検出されたが,宿主炎症反応とは関連がなかった.さらに,発症から死亡までの時間は,PCRSARS-CoV-2が確認された臓器の数とは相関していなかった.腎臓,腸,肝臓でのウイルスRNAの存在は,臓器傷害あるいは炎症の証拠とは関連していなかった.ウイルスの存在を空間的に解決することで,我々は,肺外組織では,SARS-CoV-2 Sタンパク質を含む細胞が,隣接する局所的な細胞性免疫応答(adjacent localized cellular immune response)を起こさないことを確認した.これらの所見は,マクロ的および組織学的変化を引き起こすことなく腸内で複製することができる鳥類コロナウイルスの株に関する所見と一致する(25).肺組織の異常はしばしば高度であったが,驚いたことに,肺内のSARS-CoV-2 RNAの存在の領域的分布は,肺の炎症反応の有無や性質のいずれとも直線的に関連していなかった.我々のコホートでは,ウイルスが検出された肺切片と検出されなかった肺切片において,DADと気管支肺炎のいずれも認められ,また炎症を伴わないウイルスの存在も認められた.これらの結果から,SARS-CoV-2に関連した免疫病理について,主に肺と網内系が関与する異常な免疫応答が,ウイルスの存在とは明確に位相的に関連していないことが明らかになった.致死性COVID-19の主要なメカニズムは,ウイルスに依存しない免疫病理であるという証拠が示されたことは,治療戦略として寛容性を優先することを意味している.これは,重症疾患におけるコルチコステロイドの有益な効果と一致しており(13),重要なことは,その効果の生物学的,メカニカルな根拠を提供し,現在行われている免疫調節剤や抗炎症剤の研究を有効にすることである(26)

A我々は,BALF中のCD8+T細胞の増加と肺マクロファージの減少という観察結果(15)を発展させ,nonluminal pulmonary compartment内(気腔外)で単核食細胞系の免疫細胞が著しく相対的に増加していること,また,それに続いてより少ない程度だがCD4+およびCD8+T細胞が増加していることを観察した.マクロファージの異常は骨髄にも見られ,典型的な二次性鉄過剰症の原因(輸血,溶血)がなかったにもかかわらず,1人を除くすべての患者に鉄含有マクロファージが観察され,これは,循環フェリチンが有害なアウトカムと相関するという観察結果と一致している(11)HIVC型肝炎ウイルス感染では,鉄過剰症(iron overload)が予後不良と関連しており,ウイルス感染自体がマクロファージの鉄負荷(iron loading)を増強させる可能性があり,COVID-19では鉄過剰が宿主にとって有害な異常マクロファージ反応であることがさらに示唆されている(27)

B最近の報告に一致して,我々のシリーズでは大小の肺血管の血栓が一般的であることがわかった(28-30).肺血管の血栓は,SARS(23, 31)A型インフルエンザウイルス(32, 33),および一般的な急性呼吸窮迫症候群の死亡例でも報告されているが,COVID-19の頻度はインフルエンザのそれよりも対数オーダー(log order)で高いようであり,異なる内皮傷害経路による可能性があるが(28),その要因は不明である.我々の結果では,重症COVID-19における新たな病理学的プロセスである,免疫細胞肺動脈炎(immune-cell pulmonary arteritis)が,我々の症例のほぼ半数に認められた.この肺動脈炎が,内皮細胞機能障害や血管性血栓症に寄与している可能性があり,治療の標的となりうるものである.この肺血管炎の表現型を調べると,主要な免疫細胞は,致死性インフルエンザでの報告(28)とは異なり,浸潤T細胞ではなく,血管壁に浸潤したMRP8+単核細胞であることがわかった.このCOVID-19血管炎は,肺内の他の血管では少数のCD105+内皮細胞内にSタンパク質が確認されたが,局所的な内皮におけるウイルスSタンパク質の発現とは関連していなかった.この観察結果は,肺全体の免疫微小環境を理解する必要性を証明するものであり,BALFに炎症性単球由来のマクロファージが確認されたことや(15)COVID-19の剖検サンプルに閉塞性動脈炎に関連したC5aR1+マクロファージが含まれることから,COVID-19の重要な病理学的プロセスとして単核食細胞の活性化と拡大の関与が示唆される報告(34)を考慮すると,特に興味深い.実際,C5a軸を標的とした治療が提案されている(35).この観察結果は,骨髄成長因子であるGM-CSF(顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子)や単球/マクロファージの遊走を促すケモカインであるMCP-1が血中で上昇し,COVID-19の重症度と関連しているという知見とも一致している(36, 37).今後は,炎症を起こした肺血管,肺実質,網内系組織におけるこれらのマクロファージの異常が,抗ウイルスあるいは組織修復の役割を果たしているのか,あるいは,ウイルスに対する広範な免疫応答の一部として活性化されることで,それ自体が血管および組織傷害を促進しているのかを明らかにすることが重要である.マクロファージの機能をブーストあるいは抑制する戦略に拮抗する可能性は明らかであり,早急にさらなる調査が必要である.

C致死性COVID-19では,網内系や肺における形質細胞の異常によって,異常な宿主反応の存在がさらに明らかに.形質細胞の拡大(expansion)は,急性感染症の状況下では抗体産生を確実にすることが期待されるが,我々が観察した程度は極めて顕著であった.形質細胞は形態的異型性(morphologic atypia)を示したが,反応性,多型性表現型(reactive, polytypic phenotype)を示した.これは,COVID-19患者の末梢血所見とある程度相関しており,CD4+およびCD8+T細胞の枯渇は特徴的であるが,B細胞数は維持されており,重症例ではB細胞数がより多いことが報告されている(38, 39).我々の研究における形質細胞は,一般的にMUM1+およびCD38+であったが,CD138syndecanlow/-であったことから,これらは短命な形質細胞であるか,発達の過渡期または停止期(at a transitional or arrested stage of development)にある可能性がある(40).マクロファージの挙動や鉄の蓄積に加えて,このことは,今後の治療標的の調査の優先として形質細胞を特定するものである.

Limitation: この研究は,COVID-19が他の特定の肺/全身疾患や感染症とどのように異なるかを検討するために行われたのではなく,COVID-19に関する緊急調査として行われたため,非COVID-19患者をコホートに採用しなかった.実際,COVID-19の免疫病理学的変化が他の重篤な肺損傷・炎症の原因と共通している場合は,治療介入の手段となりうる.致死性インフルエンザの組織学的所見の報告は,血栓症の文脈で上述したように,いくつかの比較を提供してくれたが,我々は,肺実質の免疫表現型に関して同様に記述されている報告を知らない.今回報告された骨髄B細胞およびマクロファージ鉄貯蔵異常は,致死性インフルエンザでは観察されておらず,したがってCOVID-19に特有である可能性がある(41, 42).この患者コホートは,年齢,侵襲的機械式換気の実施(臨床的エスカレーションの決定に基づく),実験的治療薬(コルチコステロイドおよびアジスロマイシン)の投与など,特に異質性があった(heterogeneous).バイオセーフティの観点から,ウイルス培養はできなかったが,ウイルスのRNA合成の指標として,ウイルスのサブゲノムmRNAに特有のリードを同定し,シーケンスすることで,この問題を部分的に軽減した.ウイルスRNAの検出は,非定量的マルチプレックスPCRで行ったが,定量的RT-PCRを用いてウイルス量を定量すれば,有用なデータが得られる可能性があると我々は考えている.最後に,組織の炎症を評価した病理組織医は,COVID-19の診断について盲検化されていなかった.

Conclusions

SARS-CoV-2の存在と組織の炎症との間に矛盾があることが初めて明らかになった.SARS-CoV-2 RNAは多くの臓器に分布していたが,広範な炎症反応肺および網内系のみに認められた我々は,COVID-19の死亡は,病原体を介した臓器炎症および傷害ではなく,免疫を介したものが大きく影響していると結論づける.このことは,コルチコステロイドによる免疫抑制が重症のCOVID-19の死を防ぐという最近の発見と一致しており,ウイルスに依存しない免疫病理が致死性COVID-19の主要なメカニズムの一つであることを裏付けている.このことから,COVID-19では,非傷害性臓器特異性ウイルス寛容メカニズム(noninjurious, organ-specific viral tolerance mechanisms)の理解を深め,調節不全になった免疫応答(dysregulated immune response)を標的にすることが重要であると考えられる.

References

省略.

dorward_data_supplement.pdf