COVID-19関連追加(2021114日)

COVID-19関連ARDSにおけるアンジオテンシン変換酵素2の増加とU型肺胞上皮細胞の消失】

Gerard L, et al. Increased Angiotensin-Converting Enzyme 2 and Loss of Alveolar Type II Cells in COVID-19–related Acute Respiratory Distress Syndrome.

Am J Respir Crit Care Med. Aug 27, 2021.

(Received in original form December 18, 2020; accepted in final form August 27, 2021)

https://doi.org/10.1164/rccm.202012-4461OC.

Background

ACE(アンジオテンシン変換酵素)は,レニン・アンジオテンシン(Ang)系(RAS)経路の一部をなし,血圧,および電解質や体液のホメオスタシスの調節に重要な役割を果たしている.ACEは,Ang Iを分解して,血管収縮作用と炎症促進作用を持つペプチドであるAng IIを生成するACE2は,Ang IIをより小さなペプチド(主にAng [1-7])に分解し,それはMas受容体(1)を介して,Ang IIの作用に拮抗する

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)は,宿主受容体としてACE2を利用して細胞に侵入する(2, 3)ACEおよび/またはACE2経路の改変(alterations)は,SARS-CoV (2, 4)およびSARS-CoV-2 (5)いずれの肺感染の病態生理にも寄与している可能性がある.SARS-CoVの動物実験モデルでは,ACE2と結合した後,ウイルス複合体はエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ,表面のACE2は,おそらくタンパク質分解により切断されてダウンレギュレートすることが示された(4).正式には証明されていないが,SARS-CoV-2感染時にも同様のメカニズムが起こると考えられている(3, 6).このように組織内でACE2の発現が減少すると,ACE/Ang II-ACE2/Ang 1-7)比のバランスが崩れ,急性肺傷害や心血管障害につながる可能性がある(7).さらにACE2は,さまざまな実験的な傷害によって引き起こされる実験的な急性呼吸窮迫症候群(ARDS)に対して防御を発揮することが示されている(7-11).これらを総合すると,ACE/ACE2バランスがSARS-CoV-2感染による急性肺傷害に寄与し,コロナウイルス感染症(COVID-19)の経過に影響を与える可能性が示唆されている.しかし,これまでのところ,ARDS患者におけるACEACE2の役割を評価したヒトの研究はほとんどなく(12, 13)COVID-19関連ARDS,他の原因によるARDS,そして対照の肺組織におけるACEACE2の発現を比較した研究もない.

U型肺胞上皮細胞(AT2)は,肺傷害後の肺胞表面の修復に重要な役割を果たし(14)ACE2を頻繁に発現しており(15)SARS-CoV-2の主な標的となると考えられている(16).しかし、COVID-19関連ARDS患者,COVID-19非関連ARDS患者,およびARDSではない対照患者の肺サンプル間で,これらの発現は比較されていない.我々は,COVID-19関連ARDS患者,COVID-19非関連ARDS患者,ARDSではない症例患者の3群の肺サンプルを用いて,ACE2ACEの発現分布と強度,AT2細胞の密度を調べた.我々はまた,重症SARS-CoV-2感染者,SARS-CoV-2感染と関係のないARDS患者,SARS-CoV-2感染もなく他の呼吸器疾患もない対照群の大規模コホートの血清中のACEおよびACE2レベル(およびそれぞれの代謝物)を測定した.

Methods

本研究は、2020319日〜54日の間にCliniques universitaires Saint-Luc(ベルギー・ブリュッセル)でCOVID-19と診断され死亡した,ARDSのベルリン定義(17)を満たした患者の肺の剖検標本を対象とした後ろ向き単施設研究である.

COVID-19非関連ARDS群は,20082020年の間に開肺生検で肺組織が採取され,ARDSと診断された患者のデータベース(17, 18)から後ろ向きに抽出した.

対照群は,20182019年にかけて,肺腫瘍に対して肺葉切除術を受けた患者15人の肺組織で,腫瘍病巣から距離を置いて切片を採取した.

肺組織染色(multiplex immunofluorescenceを使用)と血清中のACE濃度を、2つの異なる患者において後ろ向きに解析した.肺組織においては,AT2と内皮細胞がそれぞれProSPCpro-surfactant protein C)とCD31で染色された.

Results

Summary:

COVID-19関連および非関連ARDS患者では,肺のACE2発現が増加していた(組織領域の0.06%および0.12% vs 対照群の0.006%; それぞれP= 0.013およびP< 0.0001).ACE2は,内皮細胞ではアップレギュレートされたが(0.32%および0.53% vs 0.01%; P= 0.009およびP< 0.0001),AT2細胞ではアップレギュレートされなかった(0.13%および0.08% vs 0.03%; P= 0.94およびP= 0.44).COVID-19関連および非関連ARDSでは,肺でのACE発現が低下していた(P= 0.057およびP= 0.032).COVID-19関連ARDSの血清(P= 0.0054, P< 0.0001)とCOVID-19非関連ARDSの血清(P< 0.0001, P= 0.016)では,同様にACE2増加とACE減少が認められた.また,COVID-19関連ARDS患者では,COVID-19非関連ARDS患者に比べてAT2細胞が減少していた(1.395% vs 2.94%, P= 0.0033).

 

 

Expression of ACE2 Is Upregulated in Severe COVID-19–Related and –Unrelated ARDS:

COVID-19関連ARDS患者15人,COVID-19非関連ARDS患者13人,および対照群15人の人口統計学的特徴と補助的治療の使用状況をTable 1にまとめた.

Table 1:

ACE2染色解析により,ACE2の存在は,わずかに対照肺(全組織領域の0.006%[IQR, 0.002-0.04])に認められ,主としてproSPCを発現しているAT2AT2領域の0.03%[0.02-0.15])であった(Figure 1B).ACE2発現は,COVID-19関連ARDS(全組織領域の0.06%[0.015-0.11]; P= 0.013)(Figures 1A and 1C)およびCOVID-19非関連ARDS(全組織領域の0.12%[IQR, 0.047-0.26]; P< 0.0001)の両方で増加していた(Figure 1D).COVID-19関連ARDSと非関連ARDSの間のACE2発現の差は,統計的に有意ではなかった(P= 0.55).ProSPCで染色したAT2細胞およびCD31で染色した内皮細胞における定量化を行った(i.e., CD31+,ACE2+,and proSPC+AEC2+cells).そして,COVID-19関連およびCOVID-19非関連ARDS患者では,対照群と比較して肺内皮細胞におけるACE2の選択的なアップレギュレーションが認められた(内皮領域の0.32%[0.05-0.52], 0.53% [0.37-1.440] vs 0.01% [0.005-0.02]; P= 0.009およびP< 0.0001)(Figure 1F)が,AT2細胞ではアップレギュレーションは認められなかった(AT2領域の0.13% [0.01-0.42] および0.08% [0.025-0.16] vs 0.03% [0.02-0.15]; P= 0.94およびP= 0.44)(Figure 1G).

Figure 1: Expression of ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2) is upregulated and expression of ACE is downregulated in severe coronavirus disease (COVID-19)–related and –unrelated acute respiratory distress syndrome (ARDS). (A) One representative picture of a lung section from a patient with COVID-19–related ARDS, with corresponding high-magnification panels, is shown for distal lung tissue, costained with ProSPC (pro-surfactant protein C) (type 2 alveolar epithelial cells, green), CD31 (endothelial cells, orange), and ACE2 (yellow) and counterstained with DAPI (blue). (B–D) Sections from control subjects (B), patients with COVID-19–related ARDS (C), and patients with COVID-19–unrelated ARDS (D) were costained with ACE2 (upper panels), ACE (lower panels), CD31, and ProSPC and counterstained with DAPI (blue). One representative picture is shown for each staining. Scale bars, 50 μm. (E–G, left) Quantification of the total ACE2 area (percentage of total tissue area) (E), of the area coexpressing CD31 and ACE2 (percentage of the total CD31+area) (F), and of the area coexpressing ProSPC and ACE2 (percentage of the total proSPC area) (G), comparing control subjects (n=15) with patients with COVID-19related ARDS (n=14) and patients with COVID-19unrelated ARDS (n=13). (EG, right) Quantification of the total ACE area (percentage of total tissue area) (E), of the area coexpressing CD31 and ACE (percentage of the total CD31+area) (F), of the area coexpressing ProSPC and ACE (percentage of the total proSPC area) (G), comparing control subjects (n=12) with patients with COVID-19related ARDS (n=11) and patients with COVID-19–unrelated ARDS (n=12). Because of technical issues with the staining, data regarding ACE2/ACE could be analyzed in 15/12 out of 15 control subjects, 14/11 out of 15 COVID-19related ARDS, and 13/12 out of 13 COVID-19unrelated ARDS. (H) Relative expression of ACE and ACE2 in control subjects (n=12), patients with COVID-19related ARDS (n=11), and patients with COVID-19unrelated ARDS (n=12). The ACE/ACE2 ratio was calculated as the ratio of the total areas stained for ACE and ACE2. Data were expressed as means±SD. Each dataset was compared separately using Kruskall-Wallis test with a Dunns post hoc test. *P<0.05, **P<0.005, and ***P<0.0005. AT2=type 2 alveolar epithelial cells.

 

 

ACE2とは対照的に,肺でのACE発現(Figure 1C, lower panel, with detailed immunostaining provided in Figure E1 in the online supplement)は,COVID-19関連ARDSの肺では統計学的有意差は認められなかったが(Figure 1E),COVID-19関連ARDS(全組織領域の0.64%[0.27-1.64])およびCOVID-19非関連ARDS0.71%[0.057-1.54])(Figure 1D)は,対照群と比較して減少していた(2.11% [0.84-5.14]; それぞれP= 0.057およびP= 0.0323).共局在研究(colocalization studies)では,ACEのダウンレギュレーションは,内皮細胞(対照においてはACEが優位に発現していた)とAT2上皮細胞の両方に関係していることがわかった(Figures 1F and 1G).さらに,対照群4人とARDS患者5人を対象に,ACEACE2CD31CD45(汎白血球マーカー)の染色を行った.この代表的なサンプルを調べたところ,CD45ACE2あるいはACEの共局在は見られず,二重陽性CD31+ ACE2+(またはCD31+ ACE+)細胞は内皮細胞であることが確認された(Figures E2 and E3).

COVID-19関連および非関連ARDS患者におけるACE-ACE2シフトは,対照群と比較して,ACE/ACE2比の低下(7.99[3.4-36.7]および1.7[0.35-17.5] vs 131[91.2-514.2]; それぞれP= 0.016およびP= 0.0002)によって立証されたが,一方ARDS群間の差は統計的に有意ではなかった(P= 0.92)(Figure 1G).COVID-19患者の肺サンプルでは,この変化した比率(またはそのコンポーネント)と重症COVID-19の古典的な危険因子(年齢,男性,タバコ,動脈性高血圧,糖尿病,肥満)との相関は認められなかった(Figure E4).

 

 

AT2 Cells Are Downregulated in COVID-19–Related ARDS:

AT2細胞の数を反映するproSPC免疫染色(Figures 2A–2C, upper panels)は,COVID-19関連ARDSでは,COVID-19非関連ARDSに比べて減少していた(全組織領域の1.395%[0.1950-2.11] vs 2.94%[2.18-4.65]; P= 0.0033)(Figure 2DヒトAT2細胞の頂端部細胞膜(apical plasma membrane)に特異的なバイオマーカーである抗HTII-280(19)Figures 2A–2C, middle panels)を用いた第二の染色では,COVID-19関連ARDS患者におけるAT2細胞の減少が確認された(Figure 2F)(総組織領域の0.44%[0.25-0.61]COVID-19非関連ARDS1.2% [0.83-1.7]P = 0.0028),対照群は1.76% [0.85-1.9]P = 0.0004)であり,これらと比較しても,AT2細胞が減少していることが確認された.一方で,内皮細胞の数を反映するCD31には変化が見られなかった(Figure 2E).

Figure 2: Type 2 alveolar epithelial cells (AT2) are downregulated in coronavirus disease (COVID-19)–related acute respiratory distress syndrome (ARDS). (A–C) Sections from control subjects (A), patients with COVID-19–related ARDS (B), and patients with COVID-19–unrelated ARDS (C) were costained with CD31 (endothelial cells, orange) (upper panel), HTII-280 (middle panel), or Ki-67 (proliferative marker, red) (lower panel), and ProSPC (surfactant protein C; AT2, green) and counterstained with DAPI (blue). Arrows show representative examples of AT2 cells expressing Ki-67. Scale bars, 50 μm. (D and E). Quantification of the AT2 area (total ProSPC area/total tissue area) (D) and of the area CD31+(total CD31 area/total tissue area) (E), comparing control subjects (n=15) with patients with COVID-19related ARDS (n=15) and patients with COVID-19unrelated ARDS (n=13). (F) Quantification of the area expressing HTII-280 (total HTII-280 area/total tissue area), comparing control subjects (n=12) with patients with COVID-19related ARDS (n=14) and patients with COVID-19unrelated ARDS (n=13). (G and H) Quantification of the area expressing Ki-67+(total Ki67 area/total tissue area) (G) and of the area coexpressing Ki-67 and ProSPC (percentage of the total area ProSPC+) (H), comparing control subjects (n=14) with patients with COVID-19related ARDS (n=14) and patients with COVID-19–unrelated ARDS (n=12). Because of technical issues with the staining, data regarding HTII-280/Ki-67 could be analyzed in 12/14 out of 15 control subjects, 14/14 out of 15 COVID-19related ARDS, and 13/12 out of 13 COVID-19unrelated ARDS. Each dataset was compared separately using a Kruskall-Wallis test with a Dunn’s post hoc test. *P<0.05, **P<0.005, and ***P<0.0005.

 

 

最後に,Ki-67染色を用いてすべての増殖(proliferationを評価した(Figures 2A–2C, lower panels).Ki-67の発現は,COVID-19非関連およびCOVID-19関連ARDSのいずれにおいても,対照と比較して増加していた: 全肺組織では,0.54%(総肺組織)および0.29% vs 0.04%0.02-0.11)(P< 0.0001およびP= 0.0005),そして特にAT2細胞では0.46%AT2領域)および0.51% vs 0.13%0.06-0.32)(P= 0.014およびP= 0.046)であった(Figure 2A–2C, lower panelsしかし,COVID-19非関連ARDSCOVID-19関連ARDSの肺から採取したサンプルでは,この増殖指標に差はなかった: COVID-19非関連サンプルでは総肺組織の0.54%0.25-0.70 vs COVID-19関連サンプルでは0.29%0.16-0.58)(P= 0.232つの設定におけるAT2細胞間の特異的なKi-67染色には差がなかった: COVID-19非関連ARDSサンプルではAT2領域の0.46%0.25-1.38)およびCOVID-19関連ARDSサンプルではAT2領域の0.51%0.12-0.67)であった(P= 0.63)(Figures 2G and 2H

Expression of ACE2 Is Increased and Expression of ACE Is Decreased in the Serum of Patients with Severe COVID-19 and Non–COVID-19 ARDS:

重症COVID-19患者82人,COVID-19非関連ARDS患者24人,および対照群18人の人口統計学的特徴,補助的治療の使用,およびアウトカムをTable 2にまとめた.肺での所見と同様に,循環ACEレベルは有意に低かった(30.4ng/ml[11.4-59.8]および62.01[36.2-79] vs 113.2[89-147.8]; それぞれP< 0.0001およびP= 0. 016)(Figure 3A).一方,重症COVID-19患者およびCOVID-19非関連ARDS患者では,循環ACE2濃度が対照群に比べて有意に高かった(695.7pg/ml [224.5-1565]および1,434 [688.2-2115] vs 302.7 [24.8-398.8]; それぞれP= 0.0054およびP< 0.0001)(Figure 3B).これらの違いにより,両ARDS群でACE/ACE2比の低下が認められた(28.37 [7.69-73.95] および45.15 [23.68-76.81] vs  395.8 [220.2-1122]; それぞれP< 0.0001およびP= 0.001)(Figure 3E).我々はまた,重症COVID-19患者(その特徴をTable E2にまとめた)とCOVID-19非関連ARDS患者では,対照群と比較してAng1-7)濃度が統計的に有意に上昇していることがわかった(208pg/ml[136-295]および170[122-236] vs 24[15-40]; それぞれP< 0.0001およびP= 0.0002).一方で,ARDS患者と対照群の両方から採取したほとんどのサンプルでは,Ang II濃度は検出レベル未満であった(Figures 3C and 3D).

Table 2:

Figure 3: Quantification of ACE (angiotensin-converting enzyme), ACE2, angiotensin II (Ang II), and Ang (1–7) serum concentrations and of the relative expression of ACE to ACE2 in patients with coronavirus disease (COVID-19)–unrelated acute respiratory distress syndrome (ARDS), patients with severe COVID-19, and control subjects. (A and B) Serum concentrations of ACE (A) and ACE2 (B) were determined using ELISA in control patients (n=18), patients with severe COVID-19 (n=82), and patients with COVID-19unrelated ARDS (n=24). (C) Serum concentrations of Ang II were compared using enzyme immunoassay in control patients (n=18) and those with severe COVID-19 (n=35). Most values were below the detection threshold (0.3 pg/ml according to manufacturer’s instructions). (D) Serum concentrations of Ang (1–7) were compared using ELISA in control patients (n=18), patients with severe COVID-19 (n=35), and patients with ARDS (n=24). Because of sample availability, Ang (1–7) and Ang II could be quantified in only 35/82 patients with severe COVID-19, and no quantification of Ang II could be made in COVID-19–unrelated ARDS. (E) ACE/ACE2 ratio was calculated as the ratio of the concentrations of ACE and ACE2 (means±SD). Each dataset was compared separately using Kruskall-Wallis test with a Dunns post hoc test. *P<0.05, **P<0.005, and ***P<0.0005.

 

 

重症COVID-19患者82人を対象に行った多変量解析では,ACEACE2,およびそれらの比率は,2つの異なるモデルを用いて,ICU死亡率,または死亡率と侵襲的機械式換気の複合項目とは関連しなかった(details in Tables E3–E6).

 

Discussion

本研究は,重症COVID-19患者,ARDS患者,および対照群の肺組織および血清におけるACEおよびACE2の発現を比較した初めての研究である.COVID-19関連および非関連ARDSでは,主にACE2が内皮細胞へ誘導され,ACE2の有意な増加が観察された一方、同じ患者では,内皮細胞とU型肺胞上皮細胞のいずれにおいても,ACEはダウンレギュレートされていたこのようなACE/ACE2比の変化は,SARS-CoV-2に起因するか否かにかかわらず,すべてのARDSにおいてACEからACE2への劇的なシフトを示している

COVID-19ARDS患者の血清中には,同様のACE2増加とACE減少が観察され,Ang1-7)の増加と関連していた.

今回の研究では,ACE2の組織内での発現は低く(COVID-19関連または非関連ARDS患者では高いものの)ACE2陽性領域は総組織領域の0.2%未満であった.主にmRNAデータに基づいてACE2発現をマッピングしようとした研究がいくつかあるが,矛盾した結果が返されているので(20-23)肺のACE2の正確な分布はまだ明らかになっていない.またタンパク質レベルでのACE2の発現を取り上げた論文はほとんどない(15, 24-26)これまでで最大のシリーズでは,肺のACE2発現は非常に限られており,主にAT2細胞の小さなサブセットに限られていた(15)我々の対照群では,ACE2は主にAT2細胞に発現しているようであり,内皮細胞やairway lining cellsは時折局在する程度であった.さらに今回の研究は,患者や健常者を問わず,肺組織におけるACEの発現と分布を定量化した数少ない研究の一つである.対象切片では,ACEは通常,微小血管の多い組織で見られるように,主として内皮細胞にみられた

ARDSやコロナウイルス感染の間の肺組織におけるACEおよびACE2発現の変化に関するデータは限られている.しかしマウスモデルを用いたこれまでの研究では,ARDSの間(8),そしてSARS-CoV感染後(おそらく,ウイルスによるエンドサイトーシスやメタロプロテイナーゼADAM17による切断の増加によると推測)(4)ACE2の発現が低下(一方,ACEの肺での発現は変化しなかった(4))することが示されている.この証拠は,ACE2発現が増加し(AT2細胞によるACE2発現には変化がない),ACE発現が減少したという我々の研究と明らかに矛盾するように思える.しかし,COVID-19やインフルエンザの患者と対照者のACE2発現を比較した最近の研究でも同様の結果が得られており,最初の2群でACE2発現が,特に内皮細胞コンパートメント内において,有意に増加したことが報告されている(27)動物実験モデルとヒトのデータとの不一致は,ACE2の種に関連した制御メカニズムによって説明できるかもしれないそれゆえ,multiple single-cell RNAシーケンスデータセットを解析したところ,ヒト上皮細胞の特定のサブセット内では、ACE2発現がIFNによって刺激され(28, 29)IFN-α2およびIFN-γで処理したヒト上皮細胞は,ACE2発現のアップレギュレーションを示すことが明らかになっている(28)一方、マウスではこの反応は見られず(28),種特異的なメカニズムが示唆されている.矛盾した証拠にもかかわらず,強固なIFN-I応答は,SARS-CoV-2感染の重症化(30-33)や,様々な原因によるARDSと関連している(34-37)注目すべきことに,急性肺傷害やSARS-CoV感染の間にマウスモデルで観察されたACE2発現低下は,病態の初期に起こると考えられるが,IFN-I応答の異常とそれに続くACE2のアップレギュレーションは,病態の後期に現れる可能性がある(33)今回の研究では,肺組織の採取時期が遅かったため(COVID-19患者では中央値16日後,ARDS患者では中央値13日後),観察されたACE2発現のアップレギュレーションは,IFN-I応答の調節不全(dysregulated)に長く曝露した結果であるかもしれない

COVID-19関連ARDSと非関連ARDSの両方でACE2が増加していることを考えると,ACE/ACE2バランスのシフトは,重症COVID-19に特有のものというよりは,急性傷害に対する肺の一般的な反応であると思われる同様に,ACE/ACE2バランスのシフトは,IFN-Iとの相互作用に示されるように,おそらく時間感受性現象(time-sensitive phenomenon)であり,多くの交絡因子の影響を受けるかもしれない

我々はまた,COVID-19関連およびCOVID-19非関連ARDS患者では,対照群と比較して,血清のACE2増加およびACE減少を観察したが,これを臨床アウトカムの変化と結びつけることはできなかった.

さらに,COVID-19およびARDS患者の一部では、対照群と比較すると,Ang (1-7)が増加していたが,これはおそらく,肺組織での発現や血清濃度が増加していることが示されたACE2によるAng II(本研究ではその濃度を確実に測定できなかった)の変換の増加を反映していると考えられるしかし,循環におけるAng IIからAng (1-7)への変換は,主としてACE2とは独立している(independent)ことが最近示唆されたことから(38)Ang (1-7)の増加は,より全体的なRAS調節障害を反映しているかもしれない.重症COVID-19患者において,一貫した結果をもって,ACEACE2の濃度が最近特徴付けられている.Reindlらの報告によると,重症COVID-19患者において,疾患経過の早期から後期にかけて,酵素活性血漿ACE2濃度(enzymatically active plasma ACE2)の増加を認め,重症COVID-19と,侵襲的機械式換気下にある重症インフルエンザ患者の対照コホートとの間では,早期のACE2濃度に差はなかった(39).他の2つの後ろ向き研究では,重症COVID-19患者では,健常対照者と比較して,ACE2活性が顕著に増加していることが示された(40, 41).一方,重症および非重症COVID-19患者では,対照群と比較してACE活性が低下しており,重症群では最も低いレベルであった(42).しかし,主要なRASペプチドであるAng IIAng (1-7)に関しては,相反する結果が報告されている.初期の報告では,COVID-19患者の血漿中のAng IIレベルの増加が認められたが(43, 44),ゴールドスタンダードのアッセイを用いた最近の研究では逆の結果が示された(40)最後に,重症COVID-19では,対象あるいは軽症COVID-19と比較して,Ang (1-7)が増加することが最近示されており(40, 45),今回の結果を支持しているACE発現とAng II/Ang 1-7)レベルとの間に予想される相関関係に影響を及ぼす可能性のある他のメカニズムとしては,ACE2の切断/脱落(ADAM17による),ACE/ACE2の発現と活性の動的変化,ウイルスによる受容体占有の影響などが挙げられる

我々の研究の第二の発見は,COVID-19関連ARDSでは,対照群およびCOVID-19非関連ARDSと比較して,AT2細胞が選択的に減少していたことである.動物モデルでは,AT2細胞は,その増殖とT型肺胞上皮細胞への分化を介して,再生に大きな役割を果たしていることが示されている(14, 46).ヒトの場合,肺傷害後の再生プロセスはまだよく特徴付けされていないが,COVID-19関連およびCOVID-19非関連ARDSのいずれにおいても,AT2細胞の増殖が認められている(47, 48).しかし最近,COVID-19剖検コホートの肺のsingle-cell analysisにより,COVID-19患者ではAT2細胞が対照群に比べて有意に減少していることが明らかになり,ウイルスによって誘発された広範な細胞死が示唆された(16)我々は,COVID-19関連ARDSCOVID-19非関連ARDSの両方で,AT2細胞の細胞増殖の指標(indicators)の発現が同程度に増加していることを発見した(ProSPCKi-67の共発現の増加)(※Ki-67: 細胞周期の合成期(S期)を通じて細胞周期進行中に著しく増加)このことから,COVID-19関連ARDSにおけるAT2細胞の減少は,AT2の増殖障害に起因するものではなく,細胞死の促進が関与している可能性が高いことが示唆されるAT2細胞のアポトーシス(apoptosis)またはネクロプトーシス(necroptosis)の増加は,ウイルスによって誘発される可能性が報告されており(49),観察されたAT2細胞の減少に関与しているかもしれない.しかしこの所見から,少なくとも部分的には,死後タンパク質分解(postmortem protein degradation)に関する技術的な問題や,AT2細胞の増殖が主にARDS後期に起こるという動態の違い(47),が関係している可能性を除外することはできない

Limitation: @COVID-19サンプルは剖検によって得られたが,ARDSと対照群の組織は,それぞれ開肺生検と外科的肺葉切除術によって採取されたものであり,サンプルの性質(および疾患過程の動態)の違いがいくつかの知見に影響を与えている可能性がある.A組織の定量化に関しては,各群の患者数が限られていたため,COVID-19関連ARDSと非関連ARDSの間の小さいながらも関連性のある差を検出するには,本研究はパワー不足であった.BCOVID-19関連ARDSと非関連ARDSでは,補助的治療が異なっており,COVID-19群では,Acute Physiology and Chronic Health Evaluation IIスコアとSequential Organ Failure Assessmentスコアで測定したベースラインの重症度が同じであるにもかかわらず,腹臥位,nitric oxideECMOが多く,昇圧剤の使用割合が異常に高かった.これらの違いの多くは,COVID-19関連ARDS患者は全員が重症化して最終的に死亡したのに対し,COVID-19非関連ARDS患者は50%が最終的に生存したことに関係していると思われる.このCOVID-19関連ARDS群の組織採取時の重症度の高さが,今回の結果に影響を与えたかどうかは不明である.また,COVID-19関連ARDSと過去のCOVID-19非関連ARDSコホートを比較しているため,ARDS管理の時間的変化が,この補助的治療の違いを一部説明し,何らかの形で我々の結果に影響を与えている可能性も否定できない.CACE/ACE2血清測定に関しては,COVID-19関連ARDSと非関連ARDSでサンプリング方法が若干異なり,その結果,ICU入室から血清サンプリングまでの時間に差が認められた(COVID-19群の中央値は1日,COVID-19非関連ARDS群の中央値は2日).また、サンプリング時の疾患重症度(侵襲的機械式換気およびPaO2/FiO2比)の違いも血清濃度に影響を与えている可能性がある.さらに,サンプル数が限られていたため,COVID-19の全患者の一部でしかAng1-7)の定量を行うことができなかった.しかし,ベースラインの特徴,補助的治療の使用,およびアウトカムは,このサブセットの患者と全COVID-19患者集団とで同様であった.D後ろ向き研究の性質上,ACE2酵素活性およびAng IIAng1-7)を最適な条件(新鮮な血漿サンプル)で測定することができなかった.したがって,ELISAradioimmunoassaysで測定したAngII/Ang 1-7)濃度との間に大きな相違があることが報告されているように(50),酵素レベルと活性の間に直接的な相関関係を築くことはできなかった.しかし,上述のように,ACE/ACE2活性とAng II/Ang 1-7)濃度に関する同様の所見が最近の報告に見られ,本研究では肺組織データと一致していた.E本研究は観察研究であるため,原因となるメカニズムを調べることはできない.

これらの限界にもかかわらず,本研究は,COVID-19関連または非関連ARDSと対照の,特徴のある相対的に大規模なコホートにおいて,免疫組織化学を用いてACEACE2のいずれの肺組織における発現を比較した初めての研究である.さらに,組織切片全体を対象とした最先端の半自動定量化技術を用いたことで,観察者のバイアスが抑えられ,定量化の精度が向上した.また,肺組織におけるACEおよびACE2の発現の後ろ向き解析は,患者の前向きシリーズの血清ACEおよびACE2(およびAng [1-7])濃度の測定と組み合わせて行われ,一貫した結果が得られた.

以上のことから,重症COVID-19およびARDSのヒト肺組織および血清の後ろ向き解析では,ACEからACE2へといったACEsの発現の著しいシフトがARDS患者の肺と血清の両方で認められ,この病理学的特徴は重症COVID-19に特有のものではなく,急性肺傷害に対する肺の一般的な反応の一部であることが示唆された.一方,AT2細胞の減少は,COVID-19関連ARDSCOVID-19非関連ARDSを区別する可能性があり,そのメカニズムとしては,SARS-CoV-2による細胞死の増加が関与している可能性がある特に,AT2細胞の減少が肺線維症のリスクにおける推定される影響を検討する必要がある(Putative effects of the decreased AT2 cells on the risk of pulmonary fibrosis should, in particular, be addressed..これらの仮説を立てた結果は,ARDSの重症度,組織採取方法,補助的治療などが類似している今の患者シリーズで確認する必要がある.

 

References

1) Gheblawi M, Wang K, Viveiros A, Nguyen Q, Zhong JC, Turner AJ, et al. Angiotensin-converting enzyme 2: SARS-CoV-2 receptor and regulator of the renin-angiotensin system: celebrating the 20th anniversary of the discovery of ACE2. Circ Res 2020;126:1456–1474.

2) Li W, Moore MJ, Vasilieva N, Sui J, Wong SK, Berne MA, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 2003;426:450–454.

3) Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell 2020;181:271–280.e8.

4) Kuba K, Imai Y, Rao S, Gao H, Guo F, Guan B, et al. A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury. Nat Med 2005;11:875–879.

5) Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 2020;579:270–273.

6) Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet 2020;395:565–574.

7) Wösten-van Asperen RM, Lutter R, Specht PA, Moll GN, van Woensel JB, van der Loos CM, et al. Acute respiratory distress syndrome leads to reduced ratio of ACE/ACE2 activities and is prevented by angiotensin-(1-7) or an angiotensin II receptor antagonist. J Pathol 2011;225: 618–627.

8) Imai Y, Kuba K, Rao S, Huan Y, Guo F, Guan B, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure. Nature 2005;436:112–116.

9) Li Y, Zeng Z, Cao Y, Liu Y, Ping F, Liang M, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 prevents lipopolysaccharide-induced rat acute lung injury via suppressing the ERK1/2 and NF-κB signaling pathways. Sci Rep 2016;6:27911.

10) Zou Z, Yan Y, Shu Y, Gao R, Sun Y, Li X, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 protects from lethal avian influenza A H5N1 infections. Nat Commun 2014;5:3594.

11) Klein N, Gembardt F, Supé S, Kaestle SM, Nickles H, Erfinanda L, et al. Angiotensin-(1-7) protects from experimental acute lung injury. Crit Care Med 2013;41:e334–e343.

12) Annoni F, Orbegozo D, Rahmania L, Irazabal M, Mendoza M, De Backer D, et al. Angiotensin-converting enzymes in acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med 2019;45:1159–1160.

13) Wösten-van Asperen RM, Bos AP, Bem RA, Dierdorp BS, Dekker T, van Goor H, et al. Imbalance between pulmonary angiotensin-converting enzyme and angiotensin-converting enzyme 2 activity in acute respiratory distress syndrome. Pediatr Crit Care Med 2013;14:e438–e441.

14) Barkauskas CE, Cronce MJ, Rackley CR, Bowie EJ, Keene DR, Stripp BR, et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest 2013;123:3025–3036.

15) Ortiz ME, Thurman A, Pezzulo AA, Leidinger MR, Klesney-Tait JA, Karp PH, et al. Heterogeneous expression of the SARS-coronavirus-2 receptor ACE2 in the human respiratory tract. EBioMedicine 2020;60:102976.

16) Delorey TM, Ziegler CGK, Heimberg G, Normand R, Yang Y, Segerstolpe Å, et al. COVID-19 tissue atlases reveal SARS-CoV-2 pathology and cellular targets. Nature 2021;595:107–113.

17) Ranieri VM, Rubenfeld GD, Thompson BT, Ferguson ND, Caldwell E, Fan E, et al.; ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition. JAMA 2012;307:2526–2533.

18) Gerard L, Bidoul T, Castanares-Zapatero D, Wittebole X, Lacroix V, Froidure A, et al. Open lung biopsy in nonresolving acute respiratory distress syndrome commonly identifies corticosteroid-sensitive pathologies, associated with better outcome. Crit Care Med 2018;46:907–914.

19) Gonzalez RF, Allen L, Gonzales L, Ballard PL, Dobbs LG. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. J Histochem Cytochem 2010;58:891–901.

20) Bunyavanich S, Do A, Vicencio A. Nasal gene expression of angiotensin-converting enzyme 2 in children and adults. JAMA 2020;323:2427–2429.

21) Han T, Kang J, Li G, Ge J, Gu J. Analysis of 2019-nCoV receptor ACE2 expression in different tissues and its significance study. Ann Transl Med 2020;8:1077.

22) Liao M, Liu Y, Yuan J, Wen Y, Xu G, Zhao J, et al. Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19. Nat Med 2020;26:842–844.

23) Li MY, Li L, Zhang Y, Wang XS. Expression of the SARS-CoV-2 cell receptor gene ACE2 in a wide variety of human tissues. Infect Dis Poverty 2020;9:45.

24) Hamming I, Timens W, Bulthuis ML, Lely AT, Navis G, van Goor H. Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis. J Pathol 2004;203:631–637.

25) Ren X, Glende J, Al-Falah M, de Vries V, Schwegmann-Wessels C, Qu X, et al. Analysis of ACE2 in polarized epithelial cells: surface expression and function as receptor for severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus. J Gen Virol 2006;87: 1691–1695.

26) Lee IT, Nakayama T, Wu CT, Goltsev Y, Jiang S, Gall PA, et al. ACE2 localizes to the respiratory cilia and is not increased by ACE inhibitors or ARBs. Nat Commun 2020;11:5453.

27) Ackermann M, Verleden SE, Kuehnel M, Haverich A, Welte T, Laenger F, et al. Pulmonary vascular endothelialitis, thrombosis, and angiogenesis in covid-19. N Engl J Med 2020;383:120–128.

28) Ziegler CGK, Allon SJ, Nyquist SK, Mbano IM, Miao VN, Tzouanas CN, et al.; HCA Lung Biological Network. Electronic address: lung-network@humancellatlas.org; HCA Lung Biological Network. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell 2020;181:1016–1035.e19.

29) Sajuthi SP, DeFord P, Li Y, Jackson ND, Montgomery MT, Everman JL, et al. Type 2 and interferon inflammation regulate SARS-CoV-2 entry factor expression in the airway epithelium. Nat Commun 2020;11:5139.

30) Lee JS, Shin EC. The type I interferon response in COVID-19: implications for treatment. Nat Rev Immunol 2020; 20:585–586.

31) Blanco-Melo D, Nilsson-Payant BE, Liu WC, Uhl S, Hoagland D, Møller R, et al. Imbalanced host response to SARS-CoV-2 drives development of COVID-19. Cell 2020;181:1036–1045.e9.

32) Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al.; Yale IMPACT Team. Longitudinal analyses reveal immunological misfiring in severe COVID-19. Nature 2020;584:463–469.

33) Galani IE, Rovina N, Lampropoulou V, Triantafyllia V, Manioudaki M, Pavlos E, et al. Untuned antiviral immunity in COVID-19 revealed by temporal type I/III interferon patterns and flu comparison. Nat Immunol 2021;22:32–40.

34) Lee JS, Park S, Jeong HW, Ahn JY, Choi SJ, Lee H, et al. Immunophenotyping of COVID-19 and influenza highlights the role of type I interferons in development of severe COVID-19. Sci Immunol 2020;5:eabd1554.

35) Nick JA, Caceres SM, Kret JE, Poch KR, Strand M, Faino AV, et al. Extremes of interferon-stimulated gene expression associate with worse outcomes in the acute respiratory distress syndrome. PLoS One 2016;11:e0162490.

36) Grunwell JR, Stephenson ST, Mohammad AF, Jones K, Mason C, Opolka C, et al. Differential type I interferon response and primary airway neutrophil extracellular trap release in children with acute respiratory distress syndrome. Sci Rep 2020;10:19049.

37) Makris S, Paulsen M, Johansson C. Type I interferons as regulators of lung inflammation. Front Immunol 2017;8:259.

38) Serfozo P, Wysocki J, Gulua G, Schulze A, Ye M, Liu P, et al. Ang II (angiotensin II) conversion to angiotensin-(1-7) in the circulation is POP (prolyloligopeptidase)-dependent and ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2)-independent. Hypertension 2020;75: 173–182.

39) Reindl-Schwaighofer R, Hodlmoser S, Eskandary F, Poglitsch M, Bonderman D, Strassl R, et al. ACE2 elevation in severe COVID-19. Am J Respir Crit Care Med 2021;203:1191–1196.

40) van Lier D, Kox M, Santos K, van der Hoeven H, Pillay J, Pickkers P. Increased blood angiotensin converting enzyme 2 activity in critically ill COVID-19 patients. ERJ Open Res 2021;7:00848-02020.

41) Patel SK, Juno JA, Lee WS, Wragg KM, Hogarth PM, Kent SJ, et al. Plasma ACE2 activity is persistently elevated following SARS-CoV-2 infection: implications for COVID-19 pathogenesis and consequences. Eur Respir J 2021;57:2003730.

42) Zhu Z, Cai T, Fan L, Lou K, Hua X, Huang Z, et al. The potential role of serum angiotensin-converting enzyme in coronavirus disease 2019. BMC Infect Dis 2020;20:883.

43) Liu Y, Yang Y, Zhang C, Huang F, Wang F, Yuan J, et al. Clinical and biochemical indexes from 2019-nCoV infected patients linked to viral loads and lung injury. Sci China Life Sci 2020;63:364–374.

44) Wu Z, Hu R, Zhang C, Ren W, Yu A, Zhou X. Elevation of plasma angiotensin II level is a potential pathogenesis for the critically ill COVID-19 patients. Crit Care 2020;24:290.

45) Valle Martins AL, da Silva FA, Bolais-Ramos L, de Oliveira GC, Ribeiro RC, Pereira DAA, et al. Increased circulating levels of angiotensin-(1-7) in severely ill COVID-19 patients. ERJ Open Res 2021;7:00114-02021.

46) Hogan BL, Barkauskas CE, Chapman HA, Epstein JA, Jain R, Hsia CC, et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell 2014;15:123–138.

47) Abadie Y, Bregeon F, Papazian L, Lange F, Chailley-Heu B, Thomas P, et al. Decreased VEGF concentration in lung tissue and vascular injury during ARDS. Eur Respir J 2005;25:139–146.

48) Chen J, Wu H, Yu Y, Tang N. Pulmonary alveolar regeneration in adult COVID-19 patients. Cell Res 2020;30:708–710.

49) Li S, Zhang Y, Guan Z, Li H, Ye M, Chen X, et al. SARS-CoV-2 triggers inflammatory responses and cell death through caspase-8 activation. Signal Transduct Target Ther 2020;5:235.

50) Chappell MC, Pirro NT, South AM, Gwathmey TM. Concerns on the specificity of commercial ELISAs for the measurement of angiotensin (1-7) and angiotensin II in human plasma. Hypertension 2021;77:e29–e31.