COVID-19関連追加(20211112日)

【可燃性タバコおよび電子タバコへの曝露は,ACE2活性およびSARS-CoV2スパイク結合を増加させる】

Ghosh A, et al. Combustible and Electronic Cigarette Exposures Increase ACE2 Activity and SARS-CoV2 Spike Binding. Am J Respir Crit Care Med. Nov 8, 2021.

https://doi.org/10.1164/rccm.202106-1377LE.

COVID-19アウトブレイクは,グローバルヘルスに大きな影響を与えている.原因ウイルスであるSARS-CoV-2の表面にあるスパイクタンパク質は,アンジオテンシン変換酵素2ACE2)受容体に結合するメタロカルボキシペプチダーゼ(metallo-carboxypeptidase)であり,肺には膜結合型(mACE2: membrane-anchored)と可溶型(sACE2: soluble)の両方が発現している.ウイルスの侵入にはmACE2が関与しているが,最近の観察では,sACE2がスパイクタンパク質と相互作用し,受容体を介してウイルス粒子をエンドサイトーシスすることで関与していることも示唆されている(1).タバコの使用は,SARS-CoV-2感染とその後の重症化の危険因子であると推測されている(2, 3).一方,電子タバコ(electronic cigarettes)は、喫煙者の肺に有害なプロテオミクスおよび免疫変化を引き起こすことが示されている(4).さらに,ACE2発現の制御におけるvapingの効果とニコチンの役割は,動物モデルや細胞培養系で実証されている(5-8)そこで我々は,可燃性タバコ(シガレットなど)と非可燃性電子タバコ(Eシガレット)が,ACE2活性とその後のSARS-CoV-2感染(subsequent SARS-CoV-2 infection)に影響を与えるのではないかという仮説を検証した.我々のデータの一部は,これまでに国際会議で報告されており(9),プレプリントリポジトリにも寄託されている(10)

我々はまず,非スモーカー(年齢, 28.5±9.5; BMI, 28.8±7.2kg/m2; パーセンテージ予測FVC[ppFVC], 98.0±25.0; ppFEV1, 101.6±14.5; スモーカー(年齢, 34.4±8.2; BMI, 27.5±7.8kg/m2; ppFVC, 104.2±11.2; ppFEV1, 97.9±16.1),およびヴェイパー(年齢, 29.3±9.1; BMI, 29.6±8.0kg/m2; ppFVC, 106.2±11.2; ppFEV1, 104.5±7.7)を対象とした.対象者の募集基準や研究デザインの詳細は,これまでに発表されている(4, 11, 12).我々は,ACE2活性を評価するために,マイクロプレートリーダーで,ACE2特異的蛍光ペプチド(Vivitide, SFQ-3819-PI)の開裂を測定した(4)スモーカーおよびヴェイパーのBALFでは,年齢をマッチさせた非スモーカーと比較してsACE2活性が有意に増加しており(Figure 1A),両群ともSARS-CoV-2感染に対する脆弱性が高まっていることが示された

ACE2活性に対するタバコ煙の影響を評価するために,我々は初代ヒト気管支上皮細胞(HBECs: human bronchial epithelial cells)を気液界面(ALI: air-liquid interface)で繊毛細胞と杯細胞に十分分化するまで培養し(13),既報の通り(14)Kentucky research cigarettes1R6F)の煙を1日あたり14パフ,1日(急性)および4日(慢性)曝露した.急性煙曝露では,mACE2sACE2のいずれの活性も有意に増加した(Figure 1B慢性煙曝露後も,mACE2およびsACE2活性は大気対照(air controls)と比較して有意に増加していた(Figure 1Bこれらの観察結果と一致して,慢性的に煙に曝露した培養物では,ACE2タンパク質が大気曝露対照と比較して有意に増加しており(Figure 1C),SARS-CoV-2結合に利用できる受容体が増えた可能性があることを示された.我々はさらに,SARSCoV-2 スパイクタンパク質(Addgene, 145032)をその膜に含む組み換え水胞性口内炎ウイルスΔGrVSV-dG, a gift from Pengfei Wang, Columbia University)を用いた疑似ウイルスを開発し,感染細胞を識別するためにDsRedを発現させたHBECを急性および慢性のタバコ煙に曝した後,3x104U/mLの疑似ウイルスを感染させ,DsRedの発現をマイクロプレートリーダーで測定した.タバコ煙に曝露すると,DsRed蛍光が有意に増加した(ウイルス感染の増加; Figure 1D.我々は次に,慢性的に空気およびタバコ煙を曝露したHBECsを,組換えSARS-CoV-2 S1タンパク質とインキュベートした.観察されたACE2活性の増加と同様に,タバコ煙によってS1結合が有意に増加した(20%, n= 9, p= 0.024以上のことから,タバコ煙に曝露すると,ACE2活性が増加し,SARS-CoV-2結合が増加することが示された

次に,喫煙とvapingSARS-CoV-2疑似ウイルス感染に与える影響を比較するために,ACE2遺伝子を発現している初代気管気管支初代細胞(ATCC, PCS-300-010)および小気道上皮(small airway epithelis)(ATCC, PCS301-010)への疑似ウイルス感染に対するタバコ煙凝縮物(CSC: cigarette smoke condensate)およびe-liquid曝露の影響を調べた.我々は以前,これらの細胞型がACE2を発現していることを明らかにした(15).これらの異なる種類の細胞を同時に研究するために,それらを半透膜の代わりにプラスチック上でコンフルエントになるまで培養し,CSCMurty Pharmaceuticals)またはJUUL Virginia Tobacco-flavored e-liquid59mg/ml ニコチン)を様々な用量で24時間処理し(CSCの最終ニコチン濃度は,CSCでは21.6-176μMJUUL e-liquidでは364-3641μMに相当し,の最終ニコチン濃度に相当),そして疑似ウイルス(2.5-5x105U/mL)を感染させた.すべての曝露後,細胞生存率(cellular viability)は,光学顕微鏡下の陽性培養特性によって確認した.我々はその後,感染を蛍光顕微鏡で可視化し,そしてフローサイトメトリーで定量化した.CSCおよびJUUL e-liquidの両方に急性曝露したところ,DsRed蛍光が有意に増加し,対照細胞と比較して疑似ウイルスの感染が増加したことが示された(Figure 2A-Dこれらのデータは我々のBALFデータ(Figure 1A)と相関しており,タバコ(cigarettes)と電子タバコ(e-cigarettes)の両方がSARS-CoV-2感染の可能性を高めていることを示している

タバコの使用とCOVID-19の疾患重症度を調べるために,いくつかのメタアナリシスが行われているが,それらは矛盾した結果を報告している.ニコチンがSARS-CoV-2感染に対して保護的な役割を発揮するという「ニコチン仮説」が提唱された(16).逆に,喫煙とCOVID-19の疾患症状との強い関連性を確認した報告もある(2, 3).スモーカーにおけるACE2発現の増加は,COVID-19の危険因子として提案されている(17).さらに,タバコの喫煙は,インフルエンザを含むいくつかの他の呼吸器ウイルスの危険因子である(18)今回の研究では,スモーカーおよびヴェイパーのBALFsACE2がアップレギュレートされていることがin vivoでさらに証明された.しかし,本研究にはいくつかの限界がある.まず本研究は横断的でサンプル数が比較的少なく,性別,人種,その他の要因の影響を理解するためにデータセットを調べることができなかった.次に我々は,in vivosACE2のみを測定し,mACE2を測定しなかった.しかし,sACE2はレニン・アンジオテンシン系との相互作用を通じてSARS-CoV-2感染を促進しており,スモーカーやヴェイパーにおけるsACE2の上昇はSARS-CoV-2感染に寄与すると予想される(1)sACE2の増加は,細胞のACE2発現量の増加を反映している可能性が最も高い.実際,スモーカーの肺細胞では,非スモーカーの肺細胞に比べてACE2 mRNA発現が増加しており,膜結合型ACE2と可溶型ACE2の両方が増加している可能性が示唆されている(15)さらに,sACE2の上昇は,COVID-19重症度と正の相関があり(19)sACE2COVID-19リスクのマーカーとして有用であることが示されている.我々のCSC曝露のin vitro試験では,スモーカーの肺で一般的に得られるニコチン濃度(20)を再現した.JUUL e-liquidsには5%のニコチン(約300mM)が含まれている.しかし,ヒトの肺におけるJUULのニコチン濃度は不明である.それゆえ,ニコチン希釈動態により,vaping後に0.11%e-liquidが肺に沈着すると仮定して,JUUL e-liquidを細胞に約0.11%添加した.しかし,肺におけるJUULのニコチン濃度を明らかにし,異なるe-liquidsACE2レベルやSARS-CoV-2感染に同様の影響を与えるかどうかを理解するには,さらなる研究が必要である.

タバコに含まれるニコチンは,細胞のCa2+レベルを増加させる(4)Ca2+シグナルの上昇は,ウイルスの侵入,遺伝子やタンパク質の処理,その後のウイルスの放出を促進する上で重要な役割を果たしていることがよく知られている(21)今回の研究では,タバコや電子タバコ(e-liquid)曝露によって,ACE2SARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合が増加することが明らかになったそれゆえ我々は,ニコチンがスパイクタンパク質の結合を増加させ,その後の疑似ウイルス感染に関与しているのではないかと仮定する.しかし,その根本的なメカニズムやニコチンとの関連性については,さらなる研究が必要である.我々はさらに,ACE2とスパイクタンパク質の結合が急激に,しかし持続的に増加することで,タバコ使用者はSARS-CoV-2感染の危険にさらされていると推測する以上の結果から,タバコの使用はACE2の活性を上昇させ,スパイクタンパク質の結合を増加させることでSARS-CoV-2感染の可能性を高めることがわかった.今回の結果は,COVID-19の危険因子としてvapingを考慮することを強く促すものである.

 

 

Figure 1: Tobacco smoking increases ACE2 activity and SARS-CoV-2 infection.

Bronchoalveolar lavage fluids from non-smokers, smokers, and vapers (n=10 each) were concentrated and ACE2 activity was measured using 50 µM specific fluorogenic substrates. Cleaved substrate derived fluorescence as arbitrary unit (AU) following one hour of reaction was reported (A). Human bronchial epithelial cells (HBECs) were cultures at air-liquid interface (ALI) and exposed to smoke from one Kentucky research cigarette (1R6F) per day for one (acute) or four days (chronic). Apical surface was washed with PBS to collect the mucosal secretion and 50 µM fluorogenic substrate was added on the apical surface to evaluate apical ACE2 activity. ACE2 activity on apical side of acute and chronic smoke exposed cultures and corresponding apical washes (B) were reported. Activities are presented as accumulated fluorescence in arbitrary units (AU) of the cleaved products following ten minutes of reaction. Whole cell lysates were collected from chronically cigarette smoke exposed cultures, and ACE2 and GAPDH protein expressions were evaluated by immunoblotting. Representative blots were shown and GAPDH normalized ACE2 expression in air and smoke exposed cultures as fold change (C) was reported. (D) Acute or chronically smoke exposed cultures were apically exposed to Spike pseudovirus suspension and the resulting DsRed marker fluorescence was recorded after three days. Representative confocal microscopic images (SP8; Leica Microsystems) with the corresponding bright fields are shown above the DsRed fluorescence fold changes; scale bar, 100 μm. Data represented as median, lower and upper quartiles; n=8-9 per group from 3-4 different donors; p-values were provided on the graph.

 

 

 

 

Figure 2: Cigarette Smoke Condensate Exposure Increases SARS-CoV-2 Pseudovirus Infection.

Primary tracheobronchial (A) and small airway cells (B) were pre-treated with 200 μg/mL CSC (middle) and 1.00% JUUL e-Liquid (right) for 24 hours and challenged with SARSCoV-2 pseudovirus. Following incubation for 48 hours, live cells were imaged on a spinning-disc confocal microscopy system (UltraVIEW Vox; PerkinElmer). Cell nuclei were stained with Hoechst dye and infected cells were shown in red. Flow cytometry quantification of relative SARS-CoV-2 pseudovirus infection in different doses of CSC and JUUL e-Liquid pre-treated primary tracheobronchial cells (C) and small airway cells (D) were reported as fold change; n = 11-12 separate experiments. Bars represent mean ± SEM. Unpaired t test * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p < 0.0005. Scale bars, 170 μm.

 

 

 

 

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