COVID-19関連追加(20211122日)

SARS-CoV-2Delta variantは,ヒト肺細胞においてインターフェロンに対する高い感受性を維持している】

Nchioua R, et al. The Delta variant of SARS-CoV-2 maintains high sensitivity to interferons in human lung cells. bioRxiv. Nov17, 2021. Preprint.

https://doi.org/10.1101/2021.11.16.468777.

Abstract

インターフェロンは,抗ウイルス自然防御システムの主要な部分である.SARS-CoV-2を含む成功した病原体(successful pathogens)は,感染を確立するためにこれらの防御を克服する必要がある.早期のインターフェロン(IFN)誘導は,COVID-19に対して防御する.これに伴い,in vitroでは,SARS-CoV-2IFNsによって抑制され,COVID-19に対するIFNに基づいた治療法が臨床試験で検討されている.しかし,SARS-CoV-2はヒト集団への適応を続けており,その結果,伝播性の増加や予防あるいは治療法に対する感受性の減少を特徴とするvariantsが出現している.これらのいわゆる「懸念されるバリアント」(Variant of Concern: VOC)の効率的な拡散には,IFNsに対する感受性の減少も関与している可能性が示唆されている.そこで我々は,現在の4種類のVOCsAlpha, Beta, Gamma, Delta)の複製効率またはIFN感受性が,SARS-CoV-2の初期分離株と異なるかどうかを調べた.いずれのウイルスも,ヒト肺細胞ラインおよびiPSC由来U型肺胞細胞(iAT2)で複製された.Delta variantは,2020年の初期分離株と比較して,複製動態が加速し,感染性ウイルス産生量が多かったすべてのSARS-CoV-2 VOCsの複製は,外因性IIIIIIIFNsの存在下で減少した平均して,Alpha variantIFNsに対して最も感受性が低く(the least susceptibleAlphaBetaGamma variantIIIIFNsに対して抵抗性が増加したDelta variantは,ヒトでは他のすべてのvariantsを凌駕しているが,2020年初頭のSARS-CoV-2分離株と同様にIFNsに対する感受性を維持していたこのことから,IFN耐性よりも複製適性(replication fitness)の向上がその優勢の理由と考えられる.我々の結果は,VOCsの自然免疫感受性における変化を理解するのに役立ち,IFNに基づいたCOVID-19治療法を検討する臨床試験に役立つと可能性がある.

 

Results and Discussion

20202月に採取された初期のSARS-CoV-2分離株(NL-02-2020)と4つのVOC分離株の次世代シーケンス(NGS)を解析したところ,最初に入手できたWuhan-Hu-1分離株配列と比べて,S糖タンパク質(S glycoprotein)のほか,複製や自然免疫逃避に関与するタンパク質にアミノ酸の変化が見られた(Fig. 1A).VOCsSタンパク質における変異の影響は,多くの研究の焦点となっている.その中には、Sと細胞内受容体であるACE2との親和性に影響を与えるものや,Sのタンパク質分解活性化(proteolytic)を変化させるものがあり,その結果として感染性が増加する.さらに,SにおけるE484S477L452の変異は,ウイルスが獲得免疫応答を逃避することを可能にする[21,22,24].例えば,Delta variantは,いくつかのモノクローナル抗体による中和に抵抗性があり、患者血清に対する脆弱性も低いことが報告されている[21].しかし,S以外の部分における変化の影響については十分に理解されていない.Delta VOCは,Wuhan-Hu-1参照株と比べると,S領域以外に29個のアミノ酸の変化または欠失が蓄積されている(Fig. 1A).これらの中には,IFNエスケープに重要であると報告されているNsp3ORF6Nの変異が含まれている[12,25,26].しかし,これらの変異がどのような結果をもたらすのかは不明である.

Fig. 1: Amino acid differences and replication kinetics of early SARS-CoV-2 and VOCs.

A, Schematic depiction of the SARS-CoV-2 genomic arrangement and proteins (top). Outline of the specific amino acid exchanges compared to the reference Hu-1 sequence in an early European Feb 2020 SARS-CoV-2 isolate (NL-02-2020), and four variants of concern in the order of appearance: Beta (B.1.351), Alpha (B.1.1.7), Gamma (P.1) and Delta (B.1.617.2) as assessed by next-generation sequencing assembly of the full genome. B, Viral RNA in the supernatant of Calu-3 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants was quantified by qRT-PCR at indicated timepoints post infection (MOI 0.05). Day 0 wash CTRL values were subtracted from data shown in the panel. n=3±SEM. C, Infectious SARS-CoV-2 particles in the supernatant, corresponding to the 72h post-infection time point shown in (B). n=3±SEM. D, Viral RNA in the supernatant of iAT2 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants was quantified by qRT-PCR at 2 days post infection (MOI 0.5) day 0 wash control values were subtracted from data shown in the panel. n=3±SEM. Related to Fig S1.

 

 

SARS-CoV-2は呼吸器系の細胞が感染の標的となる.我々は,ヒト肺細胞ラインCalu-3において,Delta variantNL-02-2020分離株に比べて複製効率が高くFig 1B, Figs S1A and S1B),感染後3日(3 dpi)時点での感染性が約24倍高いFig 1C)ことがわかったAlphaGammaは中間的なフェノタイプを示し,BetaNL-02-2020と比較して中程度の効率で複製を行った.Delta VOCは,iPSC由来U型肺胞上皮(iAT2)細胞において,他のSARS-CoV-2分離株よりも約4倍高い複製効率を示したFig 1DAT2細胞は,肺胞上皮細胞の約60%を占め,遠位肺(distal lung)におけるSARS-CoV2の主な標的である[27].ウイルスによって誘導されたAT2細胞の消失は,COVID-19関連急性呼吸窮迫症候群の重症度[28]および肺の再生の低下(reduced lung[27]と関連している.これらを総合すると,COVID-19パンデミックで現在主流となっているDeltaは,ヒト肺細胞において最も高い複製効率を示すことが明らかになった

公表されている結果[12,29]と同様に,NL-02-2020分離株は,Calu-3細胞において,IFNα2よりもIFNβIFNγIFNλ1に対して感受性が高かった(more sensitive)(Figs 2A and 2B and Fig S2A).IFN処理は細胞の生存率(cell viability)に影響を与えなかった(Fig S2BすべてのVOCsは,NL-02-2020と同程度ではないが,外因性IFNsに対して感受性(susceptible)を示した(Figs 2A and 2B異なる濃度のIFNsの存在下でのウイルス産生の指標としてのAUC解析(Fig 2B)では,BetaおよびGamma VOCIFN処理に対して中程度(moderately),そしてAlpha variantは最も高い(8倍)抵抗性を示したIFNα2に対するAlphaDelta,特にGamma variantの感受性は310倍低下したNL-02-2020およびDeltaの各分離株と比べて,BetaAlphaGamma variantsは,IFNλ1に対する感受性(less susceptible)が約5倍低下したFig 2C注目すべきは,Delta variantは,全体的にNL-02-2020分離株と同等のIFN処理感受性(sensitive towards IFN treatment)を維持していたことである(Figs 2B and 2C

Fig 2: Interferon sensitivity of NL-02-2020 and VOCs.

A, Normalized amount of viral RNA in the supernatant of Calu-3 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants was quantified by qRT-PCR at 72h post-infection (MOI 0.05, no IFN set to 100%). Cells were infected 3 days post treatment with indicated IFNs (α2, β and γ 0.5, 5, 50 and 500 U/ml) or IFNλ1 (0.1, 1, 10 and 100 ng/ml). n=2±SEM. B, Area under the curve analysis of the data in (A) representing the replication of the variants in the presence of IFNs. Red lines indicate the average over all IFNs for one variant. C, Heatmap displaying differences in viral replication (Area under the curve analysis) of the VOCs compared to the NL-02-2020 variant upon IFN treatment of Calu-3 cells. Red, increased replication, green, decreased replication relative to replication of NL-02-2020. Data from (A). D, Normalized amount of viral RNA in the supernatant of iAT2 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants as quantified by qRT-PCR at 48h post-infection (MOI 0.5, no IFN set to 100%). Cells were infected for 2 days post treatment with indicated IFNs (α2, β and γ: 5, 50 and 500 U/ml) or IFNλ1 (1, 10 and 100 ng/ml). n=4±SEM. E, Percentage of viral RNA in the supernatant of iAT2 cells as a fraction between non-treated and IFN treated (500 IU/mL or 100 ng/mL). data from (D). Red lines indicate the average over all IFNs for one variant. F, Heatmap displaying fold differences in viral replication of the VOCs in iAT2 cells compared to the NL-02-2020 variant (set to 1) upon treatment with IFN (500 IU/mL or 100 ng/mL). Red, increased replication, green, decreased replication relative to NL-02-2020. Data from (D). Related to Figs S2 and S3.

iAT2細胞の解析では,ほとんどの場合,Calu-3細胞で得られた結果が確認された(Figs 2D-F, S3A).しかし,UIFNは,iAT2細胞ではCalu-3細胞よりもSARS-CoV-2に対する効果が低かったFig 2Dこのことは、受容体発現や経路の活性(pathway activity)が異なることを示唆している

A: Calu-3細胞, D: iAT2細胞.

それに比べて,IFNβIFNλ1は高い効果を維持し,ウイルスRNA量は2桁を超えて減少した対照では,iAT2細胞の代謝活性はIFN処理によって影響を受けないことが示された(Fig S3B非処理サンプルと比較したIFN最高用量でのウイルス量に着目すると,すべてのVOCsIFN処理に対して感受性を維持しているがFigs 2E and 2FIFN処理による影響がGammaは約3倍そしてAlphaは約4倍少ないことがわかった初期NL-02-2020株と比較すると,BetaAlphaGamma VOCsIIIIFNによる阻害に対して35倍感受性(susceptible)が低かったFig 2F

Calu-3細胞での結果と同様に,Delta variantIFNに対して依然として感受性(sensitive)があり、IFNβの場合ではさらに感受性が高かった

 

SARS-CoV-2 VOCsの出現には,ウイルスの感染性,複製効率,免疫逃避の効率など,さまざまなウイルスの特徴が寄与していると考えられる.VOCsの抗体逃避については広く研究されており[30-32],特にDelta variantは中和に対する感度が低下していた[21]。ここで我々は,Alpha variantIFNsに対する感受性の低下を示すことを確認した[23]。しかし,このVOCは,ヒト肺細胞における複製適性(replication fitness)の増加はほとんど見られなかった.それに比べて,非常に優勢であるDelta variantは,明らかに高いレベルの複製を行うが,IFNsによる阻害に対して高い感受性を維持していた.Alpha variantIFN感受性が低いため,オリジナルSARS-CoV-2株よりも優勢であったが,Delta variantの複製適合性/伝播性(replication fitness/transmission)の向上により,後に競争に敗れたと推測したくなるコロナウイルスは組み換えが起こりやすく,Alpha variantIFN耐性とDelta variantの複製適性が組み合わさることで,新たなVOCが出現する可能性があると考えられる

IFNs感受性の低下は,S以外の変異によって決定されている可能性が高い注目すべきは,IIIIFN感受性の低下を示すAlphaおよびGamma VOCsには,以前から自然免疫応答の抑制に関与しているとされているNsp6の欠失が共通していることである[12,14]SARS-CoV-2は,その遺伝子のほとんどを利用して,自然免疫防御機構を抑制,あるいは対抗する[12,14].したがって、これらのウイルスの対抗手段がウイルス伝播に重要な役割を果たしている可能性が高い.今後,SARS-CoV-2IFN感受性を低下させ,自然免疫逃避を向上させている分子決定因子(molecular determinants)について,さらなる研究が保証される.

我々の結果から,SARS-CoV-2の感染拡大と病因に重要な役割を果たしていると提唱されているヒトU型肺胞上皮細胞において,IFNβIFNλ1Delta VOCを抑制するのに最も効果的であることがわかった.この発見は、現在のパンデミックで優勢であるSARS-CoV-2 VOCに対するIFNに基づいた治療法の改善に役立つかもしれない.

 

SARS-CoV-2 stocks: SARS-CoV-2 variant B.1.351Beta),2102-cov-IM-r1-164[35]Michael Schindler教授(University of Tübingen)から,B.1.617.2Delta variantFlorian Schmidt教授(University of Bonn)から提供されたものである.また,BetaCoV/Netherlands/01/NL/2020NL-02-2020)およびB.1.1.7. (Alphavariantは,European Virus Archiveから入手した.hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 (Brazil P.1) (Gamma) (#NR-54982)分離株は,BEIリソースから入手した.

 

 

S1 Fig: Replication kinetics of NL-02-2020 and VOCs in lung cells.

A, Raw qRT-PCR Ct values obtained from supernatants of Calu-3 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants (MOI 0.05), at indicated time points. n=3±SEM. B, Exemplary standard curve used for Viral RNA loads quantification.

S2 Fig: Interferon sensitivity of NL-02-2020 and VOCs in Calu-3 cells.

A, Viral RNA levels in the supernatant of Calu-3 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants and quantified by qRT-PCR at 72h post-infection (MOI 0.05). n=2±SEM. B, Metabolic activity of Calu-3 cells after treatment with IFNs as in (A). n=3±SEM.

 

S3 Fig: Interferon sensitivity of NL-02-2020 and VOCs in iAT2 cells.

A, Viral RNA levels in the supernatant of iAT2 cells infected with indicated SARS-CoV-2 variants and quantified by qRT-PCR at 48h post-infection (MOI 0.5). (n=4±SEM). B, Metabolic activity of iAT2 cells after treatment with IFNs as indicated in panel (A). n=3±SEM.

 

 

References

1) Sparrer KMJ, Gack MU. Intracellular detection of viral nucleic acids. Curr Opin Microbiol. 2015;26: 1–9. doi:10.1016/j.mib.2015.03.001

2) Stetson DB, Medzhitov R. Type I Interferons in Host Defense. Immunity. 2006;25: 373–381. doi:10.1016/j.immuni.2006.08.007

3) Samuel CE. Antiviral Actions of Interferons. Clin Microbiol Rev. 2001;14: 778–809. doi:10.1128/CMR.14.4.778-809.2001

4) Schoggins JW. Interferon-Stimulated Genes: What Do They All Do? Annu Rev Virol. 2019;6: 567–584. doi:10.1146/annurev-virology-092818-015756

5) Kluge SF, Sauter D, Kirchhoff F. SnapShot: antiviral restriction factors. Cell. 2015;163: 774–774.e1. doi:10.1016/j.cell.2015.10.019

6) Platanias LC. Mechanisms of type-I-and type-II-interferon-mediated signalling. Nat Rev Immunol. 2005;5: 375–386. doi:10.1038/nri1604

7) Lopez J, Mommert M, Mouton W, Pizzorno A, Brengel-Pesce K, Mezidi M, et al. Early nasal type I IFN immunity against SARS-CoV-2 is compromised in patients with autoantibodies against type I IFNs. Journal of Experimental Medicine. 2021;218. doi:10.1084/jem.20211211

8) Zanoni I. Interfering with SARS-CoV-2: are interferons friends or foes in COVID-19? Curr Opin Virol. 2021;50: 119–127. doi:10.1016/j.coviro.2021.08.004

9) Sposito B, Broggi A, Pandolfi L, Crotta S, Ferrarese R, Sisti S, et al. Severity of SARS-CoV-2 infection as a function of the interferon landscape across the respiratory tract of COVID-19 patients. 2021 Mar p. 2021.03.30.437173.

doi:10.1101/2021.03.30.437173

10) Bastard P, Rosen LB, Zhang Q, Michailidis E, Hoffmann H-H, Zhang Y, et al. Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19. Science. 2020;370: eabd4585. doi:10.1126/science.abd4585

11) Zhang Q, Bastard P, Liu Z, Le Pen J, Moncada-Velez M, Chen J, et al. Inborn errors of type I IFN immunity in patients with life-threatening COVID-19. Science. 2020;370: eabd4570. doi:10.1126/science.abd4570

12) Hayn M, Hirschenberger M, Koepke L, Nchioua R, Straub JH, Klute S, et al. Systematic functional analysis of SARS-CoV-2 proteins uncovers viral innate immune antagonists and remaining vulnerabilities. Cell Reports. 2021;35: 109126.

doi:10.1016/j.celrep.2021.109126

13) Thoms M, Buschauer R, Ameismeier M, Koepke L, Denk T, Hirschenberger M, et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 2020;369: 1249–1255. doi:10.1126/science.abc8665

14) Xia H, Cao Z, Xie X, Zhang X, Chen JY-C, Wang H, et al. Evasion of Type I Interferon by SARS-CoV-2. Cell Reports. 2020;33: 108234. doi:10.1016/j.celrep.2020.108234

15) Sa Ribero M, Jouvenet N, Dreux M, Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16: e1008737.

doi:10.1371/journal.ppat.1008737

16) Vanderheiden A, Ralfs P, Chirkova T, Upadhyay AA, Zimmerman MG, Bedoya S, et al. Type I and Type III Interferons Restrict SARS-CoV-2 Infection of Human Airway Epithelial Cultures. J Virol. 2020;94: e00985–20. doi:10.1128/JVI.00985-20

17) Felgenhauer U, Schoen A, Gad HH, Hartmann R, Schaubmar AR, Failing K, et al. Inhibition of SARS–CoV-2 by type I and type III interferons. Journal of Biological Chemistry. 2020;295: 13958–13964. doi:10.1074/jbc.AC120.013788

18) Jafarzadeh A, Nemati M, Saha B, Bansode YD, Jafarzadeh S. Protective Potentials of Type III Interferons in COVID-19 Patients: Lessons from Differential Properties of Type I-and III Interferons. Viral Immunology. 2021;34: 307–320. doi:10.1089/vim.2020.0076

19) Stanifer ML, Kee C, Cortese M, Zumaran CM, Triana S, Mukenhirn M, et al. Critical Role of Type III Interferon in Controlling SARS-CoV-2 Infection in Human Intestinal Epithelial Cells. Cell Rep. 2020;32: 107863. doi:10.1016/j.celrep.2020.107863

20) Saleki K, Yaribash S, Banazadeh M, Hajihosseinlou E, Gouravani M, Saghazadeh A, et al. Interferon therapy in patients with SARS, MERS, and COVID-19: A systematic review and meta-analysis of clinical studies. Eur J Pharmacol. 2021;906: 174248. doi:10.1016/j.ejphar.2021.174248

21) Planas D, Veyer D, Baidaliuk A, Staropoli I, Guivel-Benhassine F, Rajah MM, et al. Reduced sensitivity of SARS-CoV-2 variant Delta to antibody neutralization. Nature. 2021;596: 276–280. doi:10.1038/s41586-021-03777-9

22) Harvey WT, Carabelli AM, Jackson B, Gupta RK, Thomson EC, Harrison EM, et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nat Rev Microbiol. 2021;19: 409–424. doi:10.1038/s41579-021-00573-0

23) Thorne LG, Bouhaddou M, Reuschl A-K, Zuliani-Alvarez L, Polacco B, Pelin A, et al. Evolution of enhanced innate immune evasion by the SARS-CoV-2 B.1.1.7 UK variant. 2021 Jun p. 2021.06.06.446826. doi:10.1101/2021.06.06.446826

24) Jangra S, Ye C, Rathnasinghe R, Stadlbauer D, Alshammary H, Amoako AA, et al. SARS-CoV-2 spike E484K mutation reduces antibody neutralisation. The Lancet Microbe. 2021;2: e283–e284. doi:10.1016/S2666-5247(21)00068-9

25) Kimura I, Konno Y, Uriu K, Hopfensperger K, Sauter D, Nakagawa S, et al. Sarbecovirus ORF6 proteins hamper induction of interferon signaling. Cell Rep. 2021;34: 108916. doi:10.1016/j.celrep.2021.108916

26) Liu G, Lee J-H, Parker ZM, Acharya D, Chiang JJ, van Gent M, et al. ISG15-dependent activation of the sensor MDA5 is antagonized by the SARS-CoV-2 papain-like protease to evade host innate immunity. Nat Microbiol. 2021;6: 467–478.

doi:10.1038/s41564-021-00884-1

27) Delorey TM, Ziegler CGK, Heimberg G, Normand R, Yang Y, Segerstolpe Å, et al. COVID-19 tissue atlases reveal SARS-CoV-2 pathology and cellular targets. Nature. 2021;595: 107–113. doi:10.1038/s41586-021-03570-8

28) Gerard L, Lecocq M, Bouzin C, Hoton D, Schmit G, Pereira JP, et al. Increased Angiotensin-Converting Enzyme 2 and Loss of Alveolar Type II Cells in COVID-19 Related ARDS. Am J Respir Crit Care Med. 2021 [cited 29 Oct 2021]. doi:10.1164/rccm.202012-4461OC

29) Nchioua R, Kmiec D, Müller JA, Conzelmann C, Groß R, Swanson CM, et al. SARS-CoV-2 Is Restricted by Zinc Finger Antiviral Protein despite Preadaptation to the Low-CpG Environment in Humans. Luban J, Goff SP, editors. mBio. 2020;11. doi:10.1128/mBio.01930-20

30) Bates TA, Leier HC, Lyski ZL, McBride SK, Coulter FJ, Weinstein JB, et al. Neutralization of SARS-CoV-2 variants by convalescent and BNT162b2 vaccinated serum. Nat Commun. 2021;12: 5135. doi:10.1038/s41467-021-25479-6

31) Garcia-Beltran WF, Lam EC, St. Denis K, Nitido AD, Garcia ZH, Hauser BM, et al. Multiple SARS-CoV-2 variants escape neutralization by vaccine-induced humoral immunity. Cell. 2021;184: 2372–2383.e9. doi:10.1016/j.cell.2021.03.013

32) Xie X, Liu Y, Liu J, Zhang X, Zou J, Fontes-Garfias CR, et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike 69/70 deletion, E484K and N501Y variants by BNT162b2 vaccine-elicited sera. Nat Med. 2021;27: 620–621. doi:10.1038/s41591-021-01270-4

33) Jacob A, Morley M, Hawkins F, McCauley KB, Jean JC, Heins H, et al. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Functional Lung Alveolar Epithelial Cells. Cell Stem Cell. 2017;21: 472–488.e10. doi:10.1016/j.stem.2017.08.014

34) Jacob A, Vedaie M, Roberts DA, Thomas DC, Villacorta-Martin C, Alysandratos K-D, et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019;14: 3303–3332. doi:10.1038/s41596-019-0220-0

35) Becker M, Dulovic A, Junker D, Ruetalo N, Kaiser PD, Pinilla YT, et al. Immune response to SARS-CoV-2 variants of concern in vaccinated individuals. Nat Commun. 2021;12: 3109. doi:10.1038/s41467-021-23473-6

36) Li H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arxiv:13033997 [q-bio]. 2013 [cited 11 Oct 2021]. Available:

http://arxiv.org/abs/1303.3997

37) Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25: 2078–2079.

doi:10.1093/bioinformatics/btp352

38) Grubaugh ND, Gangavarapu K, Quick J, Matteson NL, De Jesus JG, Main BJ, et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 2019;20: 8.

doi:10.1186/s13059-018-1618-7

39) Luban J, Goff SPNchioua R, Kmiec D, Müller JA, Conzelmann C, Groß R, Swanson CM, et al. SARS-CoV-2 Is Restricted by Zinc Finger Antiviral Protein despite Preadaptation to the Low-CpG Environment in Humans. Luban J, Goff SP, editors. mBio. 2020;11: 16. doi:10.1128/mBio.01930-20